Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.2. Thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn
2.4.2.1. Thu thập mẫu
- Mẫu bệnh phẩm gồm: phổi, cuống họng, lách, gan của lợn nghi mắc bệnh viêm phổi.
- Mẫu được bảo quản trong điều kiện lạnh 40C, theo quy trình bảo quản mẫu của Bộ mơn Công nghệ vi sinh - Viện Khoa học sự sống - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên và được vận chuyển ngay đến phòng nghiệm để tiến hành các xét nghiệm tiếp theo.
2.4.2.2. Phân lập và giám định vi khuẩn
Các phương pháp nuôi cấy và giám định vi khuẩn được thực hiện theo quy trình nghiên cứu thường quy của Bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên
Các mẫu bệnh phẩm được ria cấy trên các loại môi trường như nước thịt thường, thạch máu, thạch Mac Conkey, thạch chocolate. Bệnh phẩm trước khi ria cấy vào các môi trường phải dùng bơng tẩm cồn đốt mặt ngồi để diệt tạp khuẩn. Sau đó dùng kéo đã được sát trùng cẩn thận cắt sâu vào bên trong phần đã đốt, lấy
một mẩu nhỏ các mô, rồi phết lên mặt các loại môi trường thạch, đồng thời cho vào môi trường nước thịt, bồi dưỡng ở tủ ấm 37oC ở 24 giờ. Căn cứ vào tính chất mọc và hình thái của khuẩn lạc trên các mơi trường sẽ tiến hành chọn khuẩn lạc nghi của
A. pleuropneumoniae và S. suis, phết kính nhuộm gram kiểm tra hình thái vi khuẩn
dưới kính hiển vi, đồng thời tiến hành giám định vi khuẩn qua các phản ứng sinh hóa và cấy giữ giống để dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Có thể tóm tắt phương pháp ni cấy, phân lập vi khuẩn từ bệnh phẩm theo sơ đồ sau:
Sơ đồ phân lập vi khuẩn A. pleuropneumoniae
Mẫu bệnh phẩm
Nuôi cấy trên các môi trường:
Nước thịt, thạch máu, thạch Mac Conkey, thạch Chocolate Chọn, thuần khiết từng loại khuẩn lạc
Nhuộm Gram kiểm tra hình thái vi khuẩn
Giám định vi khuẩn qua các đặc tính sinh hố và lên men đường
Kiểm tra độc lực Xác định serotype
Sơ đồ phân lập vi khuẩn S. Suis
Mẫu bệnh phẩm
Nuôi cấy trên các môi trường:
Nước thịt, thạch máu, thạch Mac Conkey, thạch Chocolate Chọn, thuần khiết từng loại khuẩn lạc
Nhuộm Gram kiểm tra hình thái vi khuẩn
Giám định vi khuẩn qua các đặc tính sinh hố và lên men đường
2.4.3. Phương pháp kiểm tra các đặc tính sinh hố và khả năng lên men đường của các chủng vi khuẩn phân lập được
- Thử phản ứng Oxydase: Tiến hành trên giấy được thấm 1% dung dịch Tetrametyl-p-Phenylenediamine hydrochloride. Dùng que cấy bạch kim lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch bôi lên trên mặt giấy đã thấm thuốc thử. Nếu thấy xuất hiện màu tím đen sau 30 giây là phản ứng dương tính. Nếu khơng thấy xuất hiện màu tím đen hoặc khơng đổi màu là phản ứng âm tính.
- Thử phản ứng Catalase: Dùng phiến kính sạch, nhỏ một giọt dung dịch oxy
già (H2O2 3%) lên trên, que cấy bạch kim lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch trộn đều với giọt H2O2 3%, nếu có hiện tượng sủi bọt là phản ứng dương tính.
- Thử phản ứng sinh Indol: Cấy chủng vi khuẩn cần kiểm tra vào môi trường
nước thịt. Để tủ ấm ở 370C trong 24 giờ. Nhỏ 0,5 ml dung dịch Kovac’s vào, phản ứng dương tính khi quan sát thấy một vịng màu đỏ trên mặt môi trường.
Kiểm tra độc lực Xác định serotype
- Thử phản ứng lên men đường: Cấy chủng vi khuẩn cần kiểm tra vào môi trường nước thịt, nuôi ở tủ ấm 370C trong 24 giờ, sau đó nhỏ 0,2 ml canh khuẩn vào dung dịch đường đã chuẩn bị trước. Sau 24 giờ giữ ở tủ ấm 370C, nếu quan sát thấy màu của môi trường thay đổi thành mầu đỏ là dương tính, nếu vi khuẩn có sinh hơi sẽ thấy hơi trong ống Durham và đẩy mực nước trong ống Durham xuống.
* Phương pháp thực hiện các phản ứng nhận biết cấp I đối với S. suis
- Kiểm tra khả năng dung huyết: quan sát khả năng làm tan huyết xung quanh khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần kiểm tra sau khi đã nuôi cấy trên đĩa thạch máu cừu, ủ ở tủ ấm 37oC (5% CO2) qua 24 giờ.
+ Dung huyết kiểu α: vùng dung huyết xung quanh khuẩn lạc thường có màu xanh (dung huyết từng phần hay dung huyết khơng hồn tồn).
+ Dung huyết kiểu β: bao quanh khuẩn lạc là một vùng tan máu hoàn toàn trong suốt, có bờ rõ ràng do Hemoglobin bị phân huỷ hồn tồn.
+ Dung huyết kiểu γ (hay cịn gọi là không dung huyết): không làm biến đổi thạch máu.
- Phản ứng với KOH: dùng que cấy nhựa, phết khuẩn lạc của vi khuẩn S. suis mọc trên mơi trường thạch máu lên một phiến kính sạch. Sau khi nhỏ 1 giọt dung dịch KOH 3% không thấy có hiện tượng tạo thành lớp keo dính giữa khuẩn lạc và thuốc thử trong vịng 60 giây có nghĩa là chủng vi khuẩn kiểm tra được đánh giá là phản ứng âm tính. Vi khuẩn S. suis cho phản ứng với KOH 3% âm tính.
- Phản ứng Catalase: thực hiện tương tự như trong phản ứng với KOH, chỉ khác là thay thuốc thử KOH 3% bằng dung dịch H2O2 3%. Nếu không quan sát thấy hiện tượng sủi bong bóng trong vịng vài giây có nghĩa là chủng vi khuẩn kiểm tra sẽ được đánh giá là có phản ứng Catalase âm tính. Vi khuẩn S. suis cho phản ứng Catalase âm tính.
- Kiểm tra khả năng phát triển trong môi trường NaCl 6.5%: Chủng vi khuẩn cần kiểm tra được cấy vào môi trường NaCl 6.5%. Sau khi ủ ở tủ ấm 37oC trong 24 giờ, nếu quan sát khơng thấy mơi trường có hiện tượng đục là phản ứng âm tính. Vi khuẩn S. suis khơng phát triển trong mơi trường NaCl 6.5% (phản ứng âm tính).
* Phương pháp thực hiện hệ thống API 20 Strep đối với S. suis
Sau khi thực hiện phản ứng nhận biết cấp I, chỉ các chủng vi khuẩn được kết luận là S. suis mới được tiến hành các phản ứng với hệ thống định danh API 20 Strep.
Việc thực hiện hệ thống API20 Strep với các chủng vi khuẩn đã được xác định là S. suis nhằm các mục đích: định danh và giám định vi khuẩn S. suis; nghiên cứu một số đặc tính sinh vật, hố học của chúng.
Cách tiến hành như sau: mỗi chủng vi khuẩn cần kiểm tra được cấy thành một lớp dày đặc trên mặt đĩa thạch máu Columbia, nuôi cấy ở 370C/24 giờ (5% CO2). Dùng tăm bông vô trùng thu hoạch vi khuẩn từ đĩa thạch, rồi hịa tan vào 2 ml nước cất vơ trùng để đạt được độ đục tương đương với ống số 4 của dãy so độ đục chuẩn McFarland. Trong khay nhựa đã có chứa các loại thuốc thử, tiến hành nhỏ khoảng 100µl huyễn dịch này vào mỗi lỗ đối với các phản ứng từ VP đến ADH. Phần huyễn dịch còn lại được trộn đều với 1 ampule môi trường API GP có sẵn trong bộ kit thử và nhỏ vào các lỗ cịn lại, từ ADH đến GLYG. Tồn bộ khay nhựa có chứa các phản ứng được đặt vào một giá nhựa có chứa khoảng 5 ml nước cất bên dưới để làm ẩm. Ủ ở tủ ấm 370C. Sau 4 giờ, tiến hành nhỏ các thuốc thử thích hợp: VP 1 và VP 2 đối với phản ứng VP, NIN đối với phản ứng HIP, ZYM A và ZYM B đối với các phản ứng PYRA, αGAL, βGUR, βGAL, PAL và LAP, rồi tiến hành đọc kết quả sau 10 phút. Đối với một số phản ứng, nếu kết quả chưa rõ ràng có thể đọc lại sau 24 giờ.
Cách đọc kết quả: các phản ứng được đánh giá là dương tính hay âm tính dựa vào một bảng so màu sẵn được cung cấp bởi nhà sản xuất, được tính điểm và mã hóa bằng các chữ số. Kết quả của mỗi chủng vi khuẩn, cuối cùng sẽ được hiển thị bằng một dãy số gồm 7 chữ số. Tiến hành tra bảng nhận biết để có thể kết luận chủng vi khuẩn kiểm tra thuộc loại vi khuẩn nào.