Để khảo sát khả năng dùng EDTA làm giảm ảnh hƣởng của Fe3+
, chúng tôi dùng các dung dịch Se đƣợc tạo ra nhƣ mục 3.3.1, lƣợng Fe3+ đƣợc thêm vào cố định để dung dịch cuối cùng chứa 150ppb Fe3+, hàm lƣợng EDTA thêm vào các dung dịch thay đổi sao cho ở mỗi dung dịch có nồng độ tƣơng ứng nhƣ bảng 3.12. Các dung dịch sau cùng đƣợc bảo quản nhƣ ở mục 3.3.1, sau 8h các dạng Se đƣợc xác định theo qui trình nhƣ mục 3.3.1:
Bảng 3.13: Khả năng loại trừ ảnh hƣởng của Fe3+ bằng EDTA EDTA EDTA (mol/lít) Se(IV) ppb Se(VI) ppb DMDSe ppb SeMt ppb Tổng dạng ppb 0,01 4,06 81,20% 6,22 124,4% 2,66 88,70% 2,57 85,7% 15,51 96,9% 0,05 4,09 81,80% 6,04 120,8% 2,73 91,00% 2,61 87,0% 15,47 96,7% 0,10 4,15 83,00% 5,85 117,0% 2,84 94,70% 2,75 91,7% 15,59 97,4% 0,15 4,27 85,40% 5,61 112,2% 2,91 97,00% 2.81 93,7% 15,60 97,5% 0,20 4,83 96,60% 5,03 100,6% 2,96 98,70% 2,87 95,7% 15,69 98,1% 0,25 5,04 100,8% 4,95 99,00% 2,94 98,00% 2,88 96,0% 15,81 98,8% 0,30 5,07 101,4% 4,97 99,40% 2,88 96,00% 2,91 97,0% 15,83 98,9% 0.50 5,12 102,4% 4,89 97,80% 2,93 97,70% 2,86 95,3% 15,80 98,8% 1.00 5,18 103,6% 4,82 96,40% 3,04 101,0% 2,99 99,7% 16,03 100,0%
Theo kết quả tính hiệu suất thu hồi ở bảng 3.13, cho thấy các dạng Se(IV), DMDSe, SeMt đều tăng còn Se(VI) giảm xuống, trái ngƣợc lại so với thí nghiệm chỉ thêm Fe3+ mà khơng thêm EDTA. Điều này có thể kết luận EDTA làm giảm khả năng chuyển hóa dạng Se khi có mặt của ion Fe3+, nhƣ vậy trong quá trình bảo quản mẫu nên cho EDTA để giảm khả năng ảnh hƣởng của Fe3+. Theo kết quả biểu diễn trên hình 3.5, đƣờng biểu diễn của Se(VI) đi xuống, đƣờng biểu diễn Se(IV) đi lên và giao nhau ở điểm nồng độ EDTA là 0,2M, các đƣờng biểu diễn DMDSe, SeMt cũng có xu hƣớng đi lên, các đƣờng này thay đổi không đáng kể khi EDTA ≥ 0,2M.
Nhƣ vậy có thể khẳng định q trình chuyển dạng chính khi có mặt của Fe3+ là từ Se (IV) thành Se (VI), khi thêm EDTA vào thì q trình này hầu nhƣ khơng diễn ra nữa. Chúng tôi chọn lƣợng EDTA cho vào các dung dịch để bảo quản có nồng độ cuối cùng là 0,2M.
Hình 3.5: Đánh giá khả năng loại trừ ảnh hƣởng của Fe3+ bởi EDTA 3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng các yếu tố đi kèm trong nền mẫu thực phẩm 3.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng các yếu tố đi kèm trong nền mẫu thực phẩm
3.4.1. Ảnh hưởng của chất béo stearin và cách loại trừ.
Trong quá trình chiết tách các hợp chất của Se trong mẫu bằng dung môi hữu cơ Metanol/H2O, các hợp chất hữu cơ nhƣ chất béo và protein sẽ đƣợc chiết tách cùng. Sự có mặt của chúng trong dung dịch sẽ ảnh hƣởng phần nào đến tín hiệu đo và đến kết quả phân tích các dạng Se. Để đánh giá ảnh hƣởng của chúng, chúng tôi chuẩn bị các dung dịch chứa đồng thời 4 dạng Se với nồng độ Se(IV) 5ppb, Se(VI) 5ppb, DMDSe 3ppb, SeMt 3ppb, sau đó thêm vào các lƣợng stearin khác nhau, dung dịch đƣợc định mức bằng dung dịch HCl pH=2. Các dung dịch thu đƣợc đem xác định ngay nồng độ các dạng Se theo qui trình ở mục 3.3.1.
Chúng tơi xử lý kết quả phân tích và đƣa ra ở bảng 3.14. Hiệu suất thu hồi của mỗi dạng Se đƣợc tính bằng % lƣợng Se tìm thấy so với lƣợng Se cho vào. Tổng dạng Se trong dung dịch bằng tổng các dạng tìm thấy, hiệu suất tổng dạng Se
CSe(ppb)
cũng đƣợc tính bằng % tổng dạng Se tìm thấy so với tổng dạng Se cho vào. Các kết quả tính hiệu suất thu hồi đƣợc chúng tơi biểu diễn trên bảng 3.14.
Bảng 3.14: Kết quả tính nồng độ và hiệu suất thu hồi các dạng Se trong dung dịch khi có chất béo Stearin ppb Se(IV) ppb Se(VI) ppb DMDSe ppb SeMt ppb Tổng dạng Se ppb 10 5,02 100,40% 4,83 96,60% 2,87 95,67% 2,95 98,33% 15,67 97,94% 20 5,05 101,00% 4,87 97,40% 2,74 91,33% 2,84 94,67% 15,50 96,88% 50 4,97 99,40% 4,99 99,80% 2,66 88,67% 2,77 92,33% 15,39 96,19% 100 4,86 97,20% 5,01 100,20% 2,58 86,00% 2,62 87,33% 15,07 94,19% 150 4,42 88,40% 4,86 97,20% 2,03 67,67% 2,19 73,00% 13,50 84,38% 200 4,07 81,40% 4,35 87,00% 1,41 47,00% 1,73 57,67% 11,56 72,25% 250 3,84 76,80% 4,21 84,20% 1,02 34,00% 1,38 46,00% 10,45 65,31% 300 3,41 68,20% 3,69 73,80% 0,35 11,67% 1,06 35,33% 8,51 53,19%
Theo hình 3.6, tất cả các đƣờng biểu diễn hiệu xuất thu hồi các dạng Se và tổng dạng Se đều có xu hƣớng đi xuống, đƣờng biểu diễn dạng DMDSe và SeMt là dốc nhất. Căn cứ vào hình 3.6, có thể kết luận khi hàm lƣợng chất béo trong mẫu ≥100ppb thì độ thu hồi của DMDSe, SeMt giảm xuống dƣới 80%. Điều này chúng tơi giải thích là do các dạng selen hữu cơ này có chứa gốc hiđrocacbon nên chúng sẽ phân tán vào chất béo từ đó ảnh hƣởng tới phản ứng tạo hiđrua hóa của Se, kết quả là giảm hiệu suất hiđrua hóa của chúng. Các đƣờng biểu diễn đều đi xuống, chứng tỏ chất béo chỉ ảnh hƣởng đến tín hiệu đo chứ không ảnh hƣởng đến quá trình chuyển dạng Se. Nhƣ vậy cần phải loại bỏ bớt hàm lƣợng chất béo trong mẫu trƣớc khi thực hiện phản ứng hiđrua hóa.
Hình 3.6: Hiệu suất thu hồi các dạng Se và tổng dạng Se khi có mặt Stearin
3.4.2. Ảnh hưởng của protein abumin đến tín hiệu đo
Để khảo sát ảnh hƣởng của protein abumin tới phân tích dạng selen chúng tơi làm thí nghiệm tƣơng tự nhƣ mục 3.4.1, nhƣng chỉ thay chất béo stearin bằng protein abumin với khoảng nồng độ từ 10-300 ppb, kết quả phân tích và tính hiệu suất thu hồi đƣợc đƣa ra ở bảng 3.15:
Bảng 3.15: Kết quả xác định hàm lƣợng và hiệu suất thu hồi các dạng Se khi có mặt protein Protein ppb Se(IV) ppb Se(VI) ppb DMDSe ppb SeMt ppb Tổng dạng Se ppb 10 5,08 101,60% 4,91 98,20% 2,91 97,00% 3,04 101,33% 15,94 99,63% 20 5,01 100,20% 4,87 97,40% 2,84 94,67% 3,03 101,00% 15,75 98,44% 50 5,03 100,60% 4,88 97,60% 2,75 91,67% 2,84 94,67% 15,50 96,88% 100 4,97 99,40% 4,72 94,40% 2,62 87,33% 2,79 93,00% 15,10 94,38% 150 4,92 98,40% 4,63 92,60% 2,55 85,00% 2,71 90,33% 14,81 92,56% 200 4,87 97,40% 4,47 89,40% 2,41 80,33% 2,66 88,67% 14,41 90,06% 250 4,82 96,40% 4,35 87,00% 2,37 79,00% 2,57 85,67% 14,11 88,19% 300 4,73 94,60% 4,26 85,20% 2,22 74,00% 2,42 80,67% 13,63 85,19% ppb H%
Căn cứ vào hình 3.7, chúng tơi thấy với hàm lƣợng protein trong mẫu ≤200 ppb thì hầu hết hiệu suất thu hồi của các dạng Se đều trên 80%. Tín hiệu đo mật độ quang trên máy đo khi có protein đều ổn định, độ giảm hiệu suất thu hồi các dạng Se khi có mặt protein là do phản ứng tạo hiđrua hóa bị ảnh hƣởng và độ nhớt của dung dịch tăng khi nồng độ protein tăng, ảnh hƣởng đến tốc độ di chuyển của dung dịch mẫu, tín hiệu đo bị giảm. Tuy nhiên ảnh hƣởng của protein trong dung dịch là khơng đáng kể, do q trình chiết tách các dạng Se chúng tơi thực hiện trong dung môi metanol/H2O, protein đƣợc chiết tách ra khơng nhiều. Chính vì vậy, trong phép xác định các dạng Se trong mẫu thực chỉ cần pha loãng mẫu theo tỉ lệ nhất định khơng cần thực hiện q trình tách loại protein. Tỉ lệ pha loãng các mẫu thực chúng tơi khơng tiến hành thí nghiệm, nhƣng tham khảo các tài tiệu [64] chúng tơi chọn là 1/5, sau đó kiểm tra tín hiệu đo sau và trƣớc khi pha lỗng một vài mẫu đại diện cho kết quả sai khác không nhiều. Căn cứ vào hình 3.7, chúng tơi đƣa ra nhận định sự có mặt của protein trong mẫu không làm chuyển dạng Se vì các đƣờng đều đi xuống, khơng có dạng nào tăng.
Hình 3.7: Hiệu suất thu hồi các dạng Se trong dung dịch có chứa protein
3.4.3. Loại trừ ảnh hưởng chất béo bằng cột SPE
3.4.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của cột chiết SPE
Chuẩn bị 4 dung dịch chứa 4 dạng Se: (Se(IV), Se(VI), DMDSe, SeMt) có
nồng độ 4 dạng tƣơng ứng là Se(IV) 25ppb, Se(VI) 25ppb, DMDSe 15ppb, SeMt 15ppb; hút 5ml dung dịch này đƣợc cho đi qua cột chiết pha rắn C18 đã làm sạch bằng H2O, làm khô bằng N2 với tốc độ 3ml/phút. Dung dịch thu đƣợc cho vào bình 25ml, định mức bằng nƣớc cất 2 lần có đề ion và đuổi oxi. Phổ AAS của các dung dịch này đƣợc đo ở các điều kiện nhƣ thí nghiệm trong mục 3.3.1. Kết quả tính tốn theo mơ hình: