Se(IV) Se(VI) DMDSe SeMt
Nồng độ Se qua cột 4,97 5,03 2,51 2,84
H% 99,4% 100,6% 83,6% 56,8l%
Dựa vào bảng 3.16, hiệu suất thu hồi của các dạng Se(IV) và Se(VI) khá cao (>99%), hiệu suất thu hồi của các dạng SeMt thấp nhất (56,81%), điều đó cho thấy khi cho dung dịch chứa các dạng selen đi qua cột chiết pha rắn C18 thì nồng độ các dạng selen vô cơ (Se(IV), Se(VI)) không bị ảnh hƣởng nhƣng các dạng selen hữu cơ (DMDSe và SeMt) là hợp chất ít phân cực bị lại một phần trên cột chiết.
3.4.3.2. Khảo sát ảnh hưởng tốc độ nạp mẫu
Từ các thí nghiệm ở mục 3.4.1, chúng tôi thấy rằng nồng độ chất béo =100 ppb sẽ ảnh hƣởng tới sự chuyển dạng của selen nên chúng tôi chọn nồng độ chất béo =100 ppb để khảo sát ảnh hƣởng tốc độ nạp mẫu. Thí nghiệm này đƣợc tiến hành nhƣ sau: các dung dịch Se đƣợc chuẩn bị có nồng độ nhƣ mục 3.3.1, thêm 100 ppb chất béo stearin vào dung dịch chứa selen và định mức dung dịch bằng dung môi metanol/H2O với tỷ lệ tích (9/1), bảo quản mẫu phân tích nhƣ ở mục 3.3.1. Hút ra 5ml dung dịch này cho đi qua cột chiết C18 đã làm sạch với tốc độ nạp mẫu trong khoảng từ 0,5- 5 ml/phút. Gom dung dịch thu đƣợc cho vào bình 25ml, định mức bằng nƣớc cất 2 lần đã đề ion và đuổi oxi. Phổ AAS các dung dịch này đo ở điều kiện nhƣ mục 3.3.1 đƣợc kết quả trong bảng 3.17:
Bảng 3.17: Ảnh hƣởng của tốc độ nạp mẫu tới q trình phân tích dạng Selen v nạp mẫu (ml/lít) Se(IV) ppb Se(VI) ppb DMDSe ppb SeMt ppb Tổng dạng ppb 0.5 4,87 97,40% 4,99 99,80% 1,90 63,33% 2,14 71,33% 13,90 86,88% 1 4,93 98,60% 5,02 100,0% 1,98 66,00% 2,43 81,00% 15,47 89,75% 1.5 4,96 99,20% 5,04 101,0% 2,03 67,67% 2,58 86,00% 14,61 91,31% 2 5,02 100,4% 4,85 97,00% 2,36 78,67% 2,63 87,67% 14,86 92,88% 2.5 5,04 100,8% 4,83 96,60% 2,58 86,00% 2,77 92,33% 15,22 95,13% 3 5,03 100,6% 4,84 96,80% 2,66 88,67% 2,71 90,33% 15,24 95,25% 3.5 4,99 99,80% 4,71 94,20% 2,41 80,33% 2,52 84,00% 14,63 91,44% 4 4,97 99,40% 4,65 93,00% 2,17 72,33% 2,28 76,00% 14,07 87,94% 5 4,84 96,80% 4.57 91,40% 1,85 61,67% 2,01 67,00% 13,27 82,94%
Hình 3.8: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng tốc độ nạp mẫu tới q trình phân tích dạng Selen
Tốc độ nạp mẫu (ml/phut) CSe(ppb)
Qua đồ thị hình 3.8, khi tốc độ nạp mẫu thay đổi thì đƣờng biểu diễn nồng độ các dạng Se(IV) và Se(VI) ổn định, hiệu suất thu hồi luôn > 90%, lƣợng selen vô cơ ra cùng với dung dịch trong mẫu. Đƣờng biểu diễn nồng độ các dạng DMDSe và SeMt lúc đầu tăng dần lên cực đại sau đó giảm dần, hiệu suất thu hồi thấp, chứng tỏ các dạng DMDSe và SeMt bị giữ lại 1 phần trên cột chiết cùng với chất béo, qua đây thấy đƣợc rằng cần phải rửa cột. Quan sát bảng 3.18 cho chúng ta thấy khi tốc độ nạp mẫu là 3ml/phút, thì hiệu suất thu hồi của 4 dạng selen là tốt nhất. Do đó, chúng tơi lựa chọn tốc độ nạp mẫu là 3ml/phút để khảo sát cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.4.3.3. Khảo sát ảnh hưởng tốc độ dung môi rửa giải
Chuẩn bị các dung dịch nhƣ thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng tốc độ nạp mẫu, nhƣng tốc độ nạp mẫu đƣợc cố định là 3ml/phút. Sau đó, rửa giải bằng dung mơi metanol/H2O với tỷ lệ thể tích là 5/5, 5ml dung mơi đƣợc chảy qua cột chiết với tốc độ thay đổi từ 0,5-5ml/ phút nhằm mục đích rửa giải lƣợng Se bị giữ lại. Các điều kiện tiến hành khác giữ nguyên nhƣ phần 3.3.1. Kết quả đo thể hiện ở bảng 3:18.
Bảng 3.18: Ảnh hƣởng của tốc độ dung mơi rửa giải đến q trình phân tích dạng Selen v rửa giải (ml/lít) Se(IV) ppb Se(VI) ppb DMDSe ppb SeMt ppb Tổng dạng ppb 0.5 4,51 90,2% 4,64 92,8% 2,37 79,00% 2,55 85,00% 14,07 87,94% 1 4,63 92,60% 4,75 95,00% 2,41 80,33% 2,58 86,00% 14,37 89,81% 1.5 4,85 97,00% 4,82 96,40% 2,44 81,33% 2,67 89,00% 14,78 91,31% 2 4,94 98,80% 4,87 97,4% 2,58 86,00% 2,71 90,33% 15,1 92,38% 2.5 5,02 100,4% 4,96 99,20% 2,67 89,00% 2,83 94,33% 15,48 96,75% 3 5,04 100,8% 5,01 100,2% 2,79 93,00% 2,87 95,67% 15,71 98,19% 3.5 5,03 100,6% 5,01 100,2% 2,73 91,00% 2,85 95,00% 15,62 97,63% 4 5,01 100,2% 5,03 100,6% 2,75 91,67% 2,72 90,67% 15,51 96,94% 5 4,99 99,8% 4,96 99,2% 2,62 61,67% 2,63 67,00% 15,2 95,00%
Hình 3.9: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng tốc độ dung mơi rửa giải đến q trình phân tích dạng selen
Từ đồ thị 3.9 và bảng 3.18, ban đầu tốc độ dung môi rửa giải thay đổi thì nồng độ các dạng selen tăng dần, khi tốc độ dung môi rửa giải nằm trong khoảng từ 2-5 ml/phút nồng độ các dạng selen ổn định, hiệu suất thu hồi của selen tổng >94%. Tốc độ dung môi rửa giải 3ml/phút hiệu suất chiết sẽ lớn nhất. Do đó, chúng tơi chọn tốc độ dung môi rửa giải 3ml/phút để thực hiện các thí nghiệm về sau.
3.4.3.4. Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ dung mơi rửa giải
Có rất nhiều dung mơi khác nhau đƣợc dùng để rửa giải cột chiết pha rắn nhƣ etanol, metanol, điclometan…. Qua tìm hiểu và nghiên cứu chúng tơi lựa chọn dung môi MeOH/H2O là dung môi rửa giải các dạng selen trong mẫu thực phẩm. Tuy nhiên, cần phải chọn một tỉ lệ MeOH/H2O thích hợp sao cho thu hồi đƣợc phần lớn lƣợng selen ra khỏi mẫu phân tích mà vẫn loại bỏ đƣợc các thành phần nền mẫu. Do đó, tiến hành khảo sát ảnh hƣởng tỷ lệ dung môi rửa giải, chúng tôi cũng chuẩn bị các dung dịch selen nhƣ ở mục 3.3.1. Cố định tốc độ nạp mẫu và tốc độ dung môi rửa giải là 3ml/phút chỉ thay đổi tỷ lệ dung môi rửa giải metanol/H2O từ 1/9 đến 5/5.Các điều kiện thí nghiệm khác vẫn giữ nguyên nhƣ mục 3.4.1:
Tốc độ dung môi rửa giải(ml/phut)
Bảng 3.19: Ảnh hƣởng tỷ lệ dung mơi rửa giải trong q trình phân tích dạng Selen Tỷ lệ dung môi rửa giải Se(IV) ppb Se(VI) ppb DMDSe ppb SeMt ppb Tổng dạng ppb 1:9 4,94 98,80% 5,02 100,4% 2,26 75,33% 2,65 88,33% 14,87 92,94% 2:8 5,02 100,4% 5,06 101,2% 2,47 82,33% 2,69 89,67% 15,24 95,25% 3:7 5,04 100,8% 5,01 100,2% 2,59 86,33% 2,83 94,33% 15,47 96,69% 4:6 4,95 99,00% 4,96 99,20% 2,57 85,67% 2,97 99,00% 15,45 96,56% 5:5 4,82 96,40% 4,99 99,80% 2,69 89,67% 3,01 100,3% 15,51 96.94% 6:4 4,74 94,80% 4,84 96,80% 2,74 91,33% 2,89 96,33% 15,21 95,25% 7:3 4,61 92,20% 4,72 94,40% 2,51 83,67% 2,62 87,33% 14,46 90,38% 8:2 4,47 89,40% 4,65 93,00% 2,33 77,67% 2,37 79,00% 13,82 86,38% 9:1 4,36 87,20% 4,57 91,40% 1,74 58,00% 2,18 72,67% 12,85 80,31%
Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn ảnh hƣởng tỷ lệ dung mơi rửa giải đến q trình
CSe (ppb)
Qua bảng 3.19 và hình vẽ 3.10, thay đổi tỷ lệ dung mơi rửa giải thì nồng độ các dạng selen tăng dần đến cực đại xong sau đó giảm dần, dạng DMDSe bị ảnh hƣởng nhiều nhất DMDSe là chất không phân cực nên DMDSe sẽ bị giữ lại một phần trên cột chiết.
Nồng độ các dạng selen ổn định nhất khi tỷ lệ dung môi rửa cột MeOH/H2O trong khoảng 2/8 - 6/4. Có thể chọn tỷ lệ dung môi trong khoảng này để rửa giải. Tuy nhiên, khi phân tích mẫu thực tế, hàm lƣợng selen trong mẫu thấp nên chọn tỷ lệ thể tích dung mơi MeOH/H2O 5/5 để hiệu suất rửa giải đƣợc tốt nhất.
3.5. Phân tích mẫu thực tế
3.5.1. Khảo sát tỉ lệ dung môi chiết
Tổng kết các cơng trình về phân tích dạng Se trong các đối tƣợng thực phẩm thấy rằng: hỗn hợp MeOH/H2O thƣờng đƣợc sử dụng để chiết các dạng Se trong đối tƣợng thực phẩm. Tuy nhiên, cần phải chọn một tỉ lệ MeOH/H2O thích hợp làm dung môi chiết cho hiệu suất cao nhất. Chúng tôi tiến hành thay đổi tỷ lệ dung môi chiết MeOH/H2O từ 5/5 đến 9/1 khi tiến hành chiết các dạng Se trong một mẫu hải sản đại diện có hàm lƣợng Se lớn nhất. Kết quả thể hiện trên hình 3.11.
Hình 3.11: Ảnh hƣởng tỉ lệ Methanol/H2O đến khả năng chiết các dạng Se
CSe ppb
Kết quả (hình 3.11) cho thấy khi hàm lƣợng Methanol trong mẫu tăng thì khả năng chiết các dạng Se tăng. Tuy nhiên hàm lƣợng các dạng DMDSe và Se(IV) biến đổi khơng nhiều, cịn dạng SeMt và Se(VI) tăng đáng kể. Điều này có thể giải thích do hàm lƣợng các dạng DMDSe và Se(IV) trong mẫu thấp, các dạng SeMt và Se(VI) cao hơn. Sự chênh lệch hàm lƣợng Se thu đƣợc khi dùng dung môi chiết ở tỉ lệ 8/2 và 9/1 khơng nhiều, đƣờng cong có độ dốc khơng lớn, có thể chọn tỉ lệ Methanol/H2O 8/2 làm dung môi, tuy nhiên do hàm lƣợng Se trong các mẫu thƣờng thấp nên để tách hoàn tồn hơn chúng tơi chọn tỉ lệ 9/1 làm dung mơi chiết cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng thời gian rung siêu âm
Mẫu đại diện chứa lƣợng selen lớn nhất sau khi đƣợc nghiền mịn cho vào ống nghiệm có nắp vặn PE, thêm 5ml dung mơi metanol/H2O theo tỷ lệ thể tích 9/1 lắc chiết siêu âm trong khoảng thời gian thay đổi từ 10- 70 phút. Kết quả thể hiện trên hình 3.12:
Hình 3.12: Ảnh hƣởng của thời gian rung siêu âm đến khả năng chiết dạng selen selen
Quan sát hình 3.12, chúng ta thấy nồng độ các dạng selen tăng nhẹ trong khoảng thời từ 10- 40 phút. Khi thời gian > 40 phút thì nồng độ các dạng selen
nhƣ chiết ra hồn tồn khỏi mẫu. Do đó chúng tơi chọn thời gian rung siêu âm là 40 phút cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.5.3. Ảnh hưởng của số lần chiết lặp
Để khảo sát ảnh hƣởng số lần chiết lặp chúng tơi làm thí nghiệm nhƣ sau lấy mẫu đại diện chứa lƣợng selen lớn nhất sau đó tiến hành thay đổi số lần chiết lặp trong khoảng 1- 6 lần. Kết quả thể hiện qua hình 3.13.
Hình 3.13: Ảnh hƣởng của số lần chiết lặp đến khả năng chiết dạng Selen
Từ hình 3.13, nồng độ các dạng selen tăng khi số lần chiết lặp trong khoảng 1-3 lần. Số lần chiết lặp >3 thì nồng độ các dạng selen là không đổi. Nên chúng tôi chọn số lần chiết lặp là 3 lần để làm các thí nghiệm tiếp theo.
Tóm lại: Chúng tơi sẽ chọn tỷ lệ dung môi chiết MeOH/H2O là 9/1, thời gian rung siêu âm là 40 phút, số lần chiết lặp là 3 lần áp dụng để phân tích mẫu thực tế.
3.5.4. Hiệu suất thu hồi
Để đánh giá hiệu suất chiết các dạng Se trong các mẫu thực của dung môi đã chọn, chúng tôi cho thêm từng dạng Se với hàm lƣợng 5ppb vào trong một vài mẫu đại diện trƣớc khi tiến hành qui trình chiết nhƣ ở mục 3.5.1. Lƣợng Se tìm thấy đƣợc qui đổi về cùng thể tích dung dịch Se đã cho vào, hiệu suất thu hồi đƣợc tính theo cơng thức lƣợng Se tìm thấy bằng hiệu Se trong mẫu trƣớc và sau khi thêm. Kết quả phân tích trình bày ở bảng 3.20.
Bảng 3.20: Hiệu suất thu hồi của dung môi chiết (methanol:H2O 9:1)
STT Mẫu
Se trƣớc khi thêm (ppb) Se sau khi thêm (ppb) Hiệu suất thu hồi (%)
Se (IV)
Se
(VI) DMDSe SeMt
Se (IV)
Se
(VI) DMDSe SeMt
Se (IV)
Se
(VI) DMDSe SeMt
1 1,8 5,4 1,5 7,3 6,6 9,8 6,1 11,9 96 88 92 92
2 2,7 3,5 2,7 8,6 7,4 6,9 7,3 12,7 94 68 92 82
3 0,4 6,5 4,2 5,8 5,2 10,7 8,6 10,3 96 84 88 90
4 1,9 6,9 3,6 11,1 6,4 11,2 7,7 15,4 90 86 82 86
Qua bảng 3.20 cho thấy, hiệu suất thu hồi đều đạt trên 80%, có thể nói các dạng Se đã đƣợc chiết ra khỏi mẫu gần nhƣ là hoàn toàn. Kết quả cũng cho thấy khả năng chiết của Se(VI) thấp nhất, Se(IV) cao nhất, chúng tôi cho rằng Se(VI) liên kết chặt chẽ với các chất có trong mẫu nhƣ các axit amin phân cực, các chất béo...nên khó tách hợp chất này ra khỏi mẫu.
3.5.5. Lấy mẫu thủy-hải sản và xử lí sơ bộ mẫu
Qui trình lấy mẫu thủy-hải sản: Tiến hành lấy mẫu theo quy trình lấy mẫu
vừa nghiên cứu ở mục 2.3.1.3
Địa điểm lấy mẫu: Đầm nuôi trồng thủy hải sản khu vực Pháp Vân – Thanh
Xử lý mẫu:
Qua khảo sát mẫu giả ở trên thì chúng tơi tiến hành phân tích mẫu thực tế nhƣ sau: Mẫu tôm, cá sau khi xử lý theo quy trình ở phần 2.3.1.3, chúng tôi thu đƣợc dịch trong. Và tiếp theo tiến hành loại bỏ ảnh hƣởng của các yếu tố ảnh hƣởng bằng cách: Trƣớc tiên, cho 5ml nƣớc cất 2 lần đã loại bỏ cation chạy qua cột chiết pha rắn làm bằng vật liệu C18 để loại bỏ chất bẩn trên cột, và thấm ƣớt cột. Sau đó cho dịch trong chảy qua cột chiết pha rắn với tốc độ nạp mẫu là 3ml/phút. Cuối cùng rửa giải dung dịch với tốc độ dung môi rửa giải là 3ml/ phút bằng cách cho 5ml dung mơi chiết metanol/H2O với tỷ lệ thể tích 5/5 dội qua cột chiết pha rắn để rửa giải hết cách dạng selen còn bám trên cột. Dung dịch thu đƣợc cho vào bình 25ml định mức bằng nƣớc cất hai lần, trong môi trƣờng pH=2.
3.5.6. Phân tích mẫu thực
Mẫu cá, tơm ở các khu vực đã đánh dấu trên hình 3.14 đƣợc chúng tơi thu thập theo cùng một lồi, kích cỡ khơng thay đổi. Kết quả phân tích ở các bảng 3.21 cho thấy hàm lƣợng các dạng Se trong các mẫu đều rất thấp, sự chênh lệch hàm lƣợng qua các tháng hầu nhƣ tăng không đáng kể. Điều đó cho thấy khơng có sự tích lũy Se trong các mẫu, đồng nghĩa với việc khơng có nguồn làm tăng hàm lƣợng Se một cách bất thƣờng, sự tăng lên hàm lƣợng Se là do các động vật đó hấp thu nhiều hay ít Se sẵn có trong mơi trƣờng sống. Giữa các địa điểm hàm lƣợng Se tìm thấy trong các mẫu khơng khác nhau nhiều cũng cho thấy khơng có sự phát tán Se trên diện rộng, môi trƣờng không ô nhiễm Se. Giữa các mẫu tôm và mẫu cá hàm lƣợng Se khác nhau khơng nhiều, tuy nhiên có thể thấy rõ lƣợng Se trong mẫu tôm thƣờng cao hơn mẫu cá, điều có thể do thức ăn của tơm có lƣợng Se cao hơn hoặc tơm tích lũy Se cao hơn. Trong hai loại mẫu, đối với dạng Se vơ cơ thì Se(VI) cao hơn còn dạng hữu cơ SeMt cao hơn, tuy nhiên để đánh giá q trình chuyển hóa giữa các dạng trong mẫu cần phải phân tích thêm nguồn Se cung cấp qua thức ăn. Chúng tôi lấy giá trị trung bình cao nhất của các dạng Se trong các mẫu làm hàm lƣợng Se trung bình ở khu vực khảo sát là: Se(IV) 2,0 ppb; Se(VI) 6,1ppb; DMDSe 2,6ppb; SeMth 6,5ppb.
Bảng 3.21: Kết quả phân tích mẫu thực
Địa
điểm Tháng
Dạng Selen trong mẫu cá(ppb) Dạng Selen trong mẫu tôm(ppb)
Se(IV) Se(VI) DMDSe SeMth Se(IV) Se(VI) DMDSe SeMth
1 2 1,5 4,6 0 4,9 0,9 5,2 0,4 3,6 4 1,7 5,2 0,6 6,3 1,3 6,4 0,7 4,2 6 1,8 5,4 1,5 7,3 1,7 7.2 0,9 4,8 2 2 2,1 3,2 0,2 1,6 1,6 5,2 0,7 1,9 4 2,6 4,3 0,5 1,9 2,3 6,7 1,1 2,5 6 2,9 4,8 0,4 2,6 2,7 8,1 0,9 3,7 3 2 1,8 5,4 4,2 5,8 2,7 3,5 2,7 8,6 4 2,6 6 4,3 6,1 2,5 6,2 3 8,9 6 3,1 7,1 4,5 6,3 2,9 6,7 3,1 9,3 4 2 0,4 6.5 4,2 5,8 1,2 5,2 3,3 9,4 4 0,6 6,7 5,1 6,4 1,7 5,5 3,3 10,5 6 0 9 7,3 5,9 7,7 1,9 6,9 3,6 11,1
Song song với thí nghiệm phân tích dạng, chúng tơi tiến hành phân tích tổng hàm lƣợng Selen trong mẫu thực phẩm. Quan sát bảng 3.22, chúng ta thấy đƣợc sự chênh lệch nồng độ của 4 dạng selen và hàm lƣợng Selen tổng đã nói lên rằng trong mẫu thủy-hải sản ngoài 4 dạng selen là Se(IV), Se(VI), DMDSe, SeMt cịn có những dạng selen khác. Những nguyên nhân của sự chênh lệch nồng độ sẽ đƣợc nghiên cứu trong các đề tài sau này.
Bảng 3.22: Hàm lƣợng tổng 4 dạng Se và Selen tổng ở khu vực Pháp Vân- Thanh Trì- Hà Nội
Vị trí Tháng
Tổng 4 dạng Se (ppb) Se tổng (ppb)
Mẫu cá Mẫu tôm Mẫu cá Mẫu tôm
1
2 11,0 10,1 15,7 13,2
4 13,8 12,6 16,5 16,4
2 2 7,1 9,4 11,4 17,2 4 9,3 12,6 13,2 13,5 6 10,7 15,4 18,7 18,9