Thành phần của phản ứng multiplex RT-PCR

Thứ tự Sinh phẩm Thể tích (l) Nồng độ cuối

1 RNase free water

2 Qiagen Onestep RT-PCR buffer 5X

10.0 1X

3 dNTP mix 10 mM each 2.0 400 M each

4 DiagMF 10 M DiagMR 10 M 5 DiagH5F 10 M DiagH5R 10 M 6 DiagN1F 10 M DiagN1R 10 M 7 Qiagen Onestep RT-PCR Enzyme mix 2.0

8 RNase Inhibitor 40 U/l 0.25 10 U

9 RNA của A/H5N1 5.0 1 pg – 2 g

Chu trình nhiệt của phản ứng (bảng 2.4):

Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex RT-PCR

Thứ tự Các bước Thời gian

(phút)

Nhiệt độ (oC)

1 Phiên mã ngược (RT) 30 50

2 Hoạt hoá Hot Star Taq DNA polymerase, ức chế enzyme phiên mã ngược, biến tính

cDNA ban đầu

15 95 3 Biến tính cDNA 0.5 94 4 Gắn mồi 0.5-1 51-60 5 Kéo dài 0.5-1 72 6 Số chu kỳ 35-50 7 Hoàn thiện 5 phút 72

Sản phẩm phản ứng (10 µl) được điê ̣n di trên gel agarose 2%, nhuô ̣m trong dung di ̣ch ethidium bromide 0,5 µg/ml 15 phút, quan sát và chu ̣p ảnh trên hê ̣ thống chụp ảnh gel. Kích thước các vạch DNA được so sánh với thang DNA chuẩn 100 bp (base pairs).

* Tối ƣu nồng độ các cặp mồi cho phản ứng multiplex RT-PCR:

Ban đầu, chúng tôi thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR với các nồng độ mồi đã tối ưu ở phản ứng RT-PCR. Sau đó căn cứ vào kết quả của phản ứng để thay đổi tỷ lệ các loại mồi cho phù hợp nhất. Nếu sản phẩm các đoạn DNA đích được khuếch đại khơng đều thì thực hiện tăng lượng mồi đối với các DNA đích khuếch đại ít và giảm lượng mồi đối với các DNA đích được khuếch đại nhiều để chọn ra nồng độ tối ưu nhất cho mỗi cặp mồi.

* Tối ƣu nhiệt độ gắn mồi:

Để xác định được nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho phản ứng multiplex RT-PCR, chúng tôi kiểm tra ở nhiệt độ từ 51oC đến 60oC. Chu trình nhiệt của phản ứng: Phản ứng phiên mã ngược tạo cDNA ở 50oC trong 30 phút, biến tính cDNA ban đầu ở 95oC

trong 15 phút; tiếp theo là 50 chu kỳ (94oC: 30s; 51oC - 60oC: 30s; 72oC: 45s); giai đoa ̣n kéo dài chuỗi sau cùng thực hiê ̣n ở 72o

C trong 5 phút.

*Tối ƣu thời gian kéo dài chuỗi, thời gian gắn mồi, số chu kỳ:

Thời gian kéo dài chuỗi phụ thuộc vào enzyme DNA polymerase, chiều dài sản phẩm và loại template. Chúng tôi kiểm tra ở 30 giây, 45 giây và 60 giây để tìm được thời gian kéo dài thích hợp nhất cho cả 3 đoạn DNA cần khuếch đại.

Với thời gian gắn mồi chúng tôi, cũng kiểm tra ở 30 giây, 45 giây và 60 giây. Số chu kỳ phản ứng phản ứng được kiểm tra ở 35, 40, 45 và 50 chu kỳ.

* Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng Multiplex RT-PCR:

Để đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng Multiplex RT-PCR, chúng tôi sử dụng các mẫu RNA của virus cúm A /H1N1, cúm A /H3, cúm B (Viê ̣n Vê ̣ sinh Di ̣ch tễ Trung ương cung cấp ), cúm A/H5 (Trung tâm Chẩn đoán Thú Y Trung ương cung cấp) và các mẫu DNA và RNA có sẵn trong phịng thí nghiệm để ki ểm tra xem có hiê ̣n tượng phản ứng chéo xảy ra hay không .

* Đá nh giá đô ̣ nha ̣y của phản ƣ́ng:

Chúng tôi sử dụng các gen HA, NA và M của chủng virus cúm A/H5N1 gắn vào plasmid pJET1.2/blunt (Fermentas) tạo plasmid tái tổ hợp, sau đó tiến hành tổng hơ ̣p RNA với bô ̣ sinh phẩm TranscriptAid™ T7 High Yield Transcription Kit (Fermentas). Nồng đô ̣ RNA được xác đi ̣nh bằng cách đo khả năng hấp phu ̣ ở bước sóng 260 nm trên máy Biophotometer (Eppendorf). Dựa vào nồng đô ̣ RNA và kích thước của đoa ̣n RNA đươ ̣c phiên mã có thể tính được số bản sao RNA trong mô ̣t đơn vi ̣ thể tích . Sau đó, mẫu RNA đươ ̣c pha loãng dần thành các dung di ̣ch có nồng đô ̣ giảm dần 10 lần đến 101 bản sao RNA/µl và sử du ̣ng làm mẫu chuẩn để đánh giá đô ̣ nha ̣y của phản ứng multiplex RT-PCR.

2.2.7. Thử nghiệm phản ứng Multiplex RT-PCR trên mẫu bệnh phẩm

Để kiểm tra khả năng ứng dụng của kỹ thuật multiplex RT-PCR đã chuẩn hoá vào phát hiện cúm A/H5N1 trên mẫu bệnh phẩm, chúng tôi thực hiện phản ứng trên cả mẫu bệnh phẩm đã xác định dương tính với cúm A/H5N1 và mẫu bệnh phẩm thu

thập từ gia cầm bị bệnh trong các vụ dịch cúm xảy ra ở một số tỉnh phía Bắc năm 2009.

+ Mẫu dương tính với H5N1 gồm 14 mẫu trong đó 8 mẫu RNA của H5N1 thu thập từ gia cầm (2 mẫu từ ngan, 3 mẫu từ vịt, 3 mẫu từ gà) được cung cấp bởi Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương và 6 mẫu RNA H5N1 thu thập từ người được cung cấp bởi Trung tâm Cúm Quốc gia – Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương.

+ Mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm trong các vụ dịch cúm: 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm bị bệnh trong vụ dịch.

Đồng thời chúng tơi cũng phát hiện A/H5N1 các mẫu đó bằng các phản ứng RT-PCR đã tối ưu để đánh giá độ tin cậy của phản ứng multiplex RT-PCR.

RNA tách chiết từ mẫu bệnh phẩm đươ ̣c sử du ̣ng để thực hiê ̣n phản ứng RT - PCR và multiplex RT-PCR vớ i bô ̣ kit Qiagen Onestep RT -PCR nhằm phát hiện các gen M, HA và NA dựa vào các cặp mồi đã thiết kế. Đối với mỗi mẫu bệnh phẩm chúng tôi tiến hành lặp lại 3 lần phản ứng. Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của các phản ứng RT -PCR phát hiện từng gen riêng rẽ và multiplex RT-PCR phát hiện cả 3 gen trong cùng một phản ứng đã được tối ưu ở trên.

2.2.8. Điê ̣n di và phân tích kết quả

- Chuẩn bị gel agarose:

Hòa tan 2 (gr) agarose trong 100 ml TBE 1X bằng lò vi sóng (2-3 phút). Để nguô ̣i agarose (50-60o

C) rồi đổ vào khay đổ gel có cài sẵn răng lươ ̣c . Đợi khoảng 20-30 phút cho gel đông hoàn toàn gỡ răng lươ ̣c ra.

- Điện di sản phẩm RT-PCR và multiplex RT-PCR:

Sử du ̣ng 10 l sản phẩm RT-PCR và thang DNA chuẩn 100 pb để chạy điện

di trong dung di ̣ch TBE 1X, hiê ̣u điê ̣n thế 100 Volts với thời gian là 50 phút. Sau khi điê ̣n di xong , tiến hành nhuô ̣m bản gel trong dung di ̣ch ethidium bromide 0.5

g/ml, 15 phút. Rử a nhẹ bản gel bằng nước.

- Phân tích kết quả:

+ Mẫu chứ ng dương phải có va ̣ch DNA có kích thước đúng khi so sánh với thang DNA chuẩn (gen M: 154 bp, gen H5: 371 bp, gen N1: 292 bp)

+ Các mẫu chứng âm phải không hiện vạch DNA .

+ Mẫu dương tính là mẫu có hiê ̣n va ̣ch DNA tương đương với va ̣ch DNA của mẫu chứng dương . Mẫu dương tính bằng kỹ thuật multiplex RT-PCR phải có 3 vạch DNA tương đương với 3 vạch DNA của 3 phản ứng RT-PCR.

+ Mẫu âm tính là mẫu không có va ̣ch DNA tương đương với mẫu chứng dương.

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Thiết kế mồi 3.1. Thiết kế mồi

3.1.1. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen M của virus cúm A

Để thiết kế c ặp mồi cho gen M, chúng tơi đã download 139 trình tự nucleotide gen M của virus cúm A, trong đó bao gồm đa ̣i diê ̣n của hầu hết các subtype (H1-H16 và N1-N9) đã đươ ̣c công bố trên GenBank . Các chủng virus được phân lập ở các đối tượng khác nhau như gà, gà tây, vịt, ngỗng, mòng biển, chim cút, người, mơi trường... Các trình tự này được so sán h bằng phần mềm ClustalX 2.0.11, phân tích kết quả so sánh bằng phần mềm BioEdit và FastPCR 5.4. Sau khi tiến hành các bước như trên , chúng tôi đã lựa chọn cặp mồi để khuếch đại t rình tự đặc hiê ̣u trên gen M của các chủng virus cúm A trong bảng 3.1:

Bảng 3.1: Cặp mồi phát hiện gen M của virus cúm A

Tên mời Trình tự 5’-3’ Vị trí Tm %GC

DiagMF GTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC 5-26 55.1 50 DiagMR GTGACAGGATTGGTCTTGTCTT 158-139 55.8 45.5

Cặp mồi này có trình tự trùng khớp với hầu hết các chủng virus cúm A đã download. Một sớ chủng virus cúm A có sự khác biệt ở 1 - 2 nucleotide, tuy nhiên các nucleotide này đều nằm ở đầu 5’ hoă ̣c ở giữa trình tự nên ít ảnh hưởng đến khả năng gắn mồi vào khn đích (hình 3.1).

Phân tích trên PastPCR cho thấy, mồi xuôi (DiagMF) và mồi ngược (DiagMR) phát hiện gen M có kích thước 22 nucleotide. Cặp mồi này có nhiệt độ biến tính Tm tương đương nhau khoảng 55oC, khơng có hiện tượng bắt cặp bổ sung giữa các nucleotide trong bản thân mỗi mồi. Mồi xuôi và mồi ngược chỉ cặp bổ sung nhau tạo dimer ở giá trị độ nhạy cho phát hiện dimer là 1, tuy nhiên sự bắt cặp là lỏng lẻo và các nucleotide ở đầu 3’ không bắt cặp nhau. Cặp mồi khuếch đại đoạn DNA đích trên gen M của virus cúm A có kích thước là 154 bp.

Cặp mồi được Primer - Blast với các trình tự DNA của virus cúm có trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI cho kết quả đăc hiệu trên gen M của tất cả các subtype của virus cúm A, các đoạn được khuếch đại đều có kích thước 154 bp.

3.1.2. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen HA của virus cúm A/H5N1

Để thiết kế m ồi cho gen HA của virus cúm A/H5N1, chúng tôi đã download 145 trình tự nucleotide gen HA của các chủng virus A/H5N1 (đại diê ̣n cho các khu vực trên thế giới và Viê ̣t Nam ) đã được công bố trên GenBank từ năm 2003 đến 2010. Các chủng virus A/H5N1 được sử dụng để thiết kế mồi được phân lập ở nhiều đối tượng vật chủ như gà, gà tây, vịt, ngỗng và người...

Sau khi phân tích bằng các phần mềm thiết kế mồi, chúng tôi đã lựa chọn cặp mồi khuếch đại trình tự đă ̣c hiê ̣u trên gen HA của A/H5N1 trong bảng 3.2:

Bảng 3.2: Cặp mồi phát hiện gen HA của virus cúm A/H5N1

Tên mời Trình tự 5’-3’ Vị trí Tm %GC

DiagH5F AGTGATCAGATTTGCATTGGTTAC 46-69 54.6 37.5 DiagH5R GACCAAGAACTTTTGGGGATG 416-396 55.4 47.6

Mồi xuôi (DiagH5F) và mồi ngược (DiagH5R) được lựa cho ̣n để phát hiện gen HA của H5N1 có trình tự trùng khớp với hầu hết các chủng H 5N1 đã download, chỉ có một số chủng có sự khác biệt ở 1 - 2 nucleotide ở đầu 5’ hoă ̣c ở giữa trình tự nên cũng ít ảnh hưởng đến khả năng gắn mồi vào khn đích (hình 3.2):

Hình 3.2: Đặc điểm cặp mồi phát hiện gen HA của virus cúm A/H5

Mồi xi có kích thước 24 nucleotide, mồi ngược có kích thước 21 nucleotide. Cặp mồi này khuếch đại đoạn gen HA có kích thước 371 bp. Phân tích trên PastPCR 5.4, bản thân mỗi mồi khơng có nucleotide bắt cặp bổ sung nhau và giữa các mồi không tạo dimer từ giá trị độ nhạy cho phát hiện dimer từ 2 trở đi. Nếu có sự bắt cặp cũng khơng hồn tồn đặc hiệu và chỉ ở đầu 5’ hoặc giữa các mồi. Tm của các mồi tương đương nhau khoảng 55oC.

Để kiểm tr a độ đặc hiệu của cặp mồi này với subtype H 5, chúng tôi đã thực hiện Primer - Blast với các trình tự DNA của virus cúm có trên ngân hàng dữ liệu gene của NCBI. Kết quả cho thấy, cặp mồi DiagH5F và DiagH5R chỉ khuếch đại đoạn DNA có kích thước 371 bp trên gen HA của tất cả các subtype virus cúm A/H5.

3.1.3. Thiết kế mồi đặc hiệu cho gen NA của virus cúm A/H5N1

Để thiết kế mồi cho gen NA của virus H5N1, chúng tôi đã download 92 trình tự nucleotide gen NA của cá c chủng virus H5N1 (đa ̣i diê ̣n cho các khu vực trên thế giới và Viê ̣t Nam ) đã được công bố trên GenBank từ năm 2003 đến 2010. Các chủng virus A/H5N1 được sử dụng để thiết kế mồi được phân lập ở nhiều đối tượng vật chủ như gà, gà tây, vịt, ngỗng và người...

Các trình tự gen NA này được so sán h bằng phần mềm Clustal X2.0.11, phân tích kết quả so sánh bằng phần mềm BioEdit và FastPCR 5.4. Chúng tôi đã lựa chọn được cặp khuếch đa ̣i trình tự đă ̣c hiê ̣u trên gen NA của H5N1 trong bảng 3.3: Bảng 3.3: Cặp mồi phát hiện gen NA của virus cúm A/H5N1

Tên mời Trình tự 5’-3’ Vị trí Tm %GC

DiagN1F CCAGTTGGTTGACAATTGGAAT 503-524 54.5 40.9 DiagN1R GCATCAGGATAACAGGAGCA 794-775 55.4 50.0

Các mồi xuôi (DiagN1F) và mồi ngược (DiagN1R) đươ ̣c lựa cho ̣n để khuếch đa ̣i gen NA của H 5N1 có trình tự trùng khớp với hầu hết các chủng H 5N1 đã download, chỉ có một số chủng có sự khác biệt ở 1-2 nucleotide ở đầu 5’ hoă ̣c ở giữa trình tự nên cũng ít ảnh hưởng đến khả năng gắn mồi vào khn đích (hình 3.3).

Hình 3.3: Đặc điểm cặp mồi phát hiện gen NA của virus cúm A/N1

Phân tích kết quả so sánh trên FastPCR cho thấy, mồi xuôi (22 nucleotide) và mồi ngược (20 nucleotide) có Tm tương đương nhau khoảng 55oC. Khơng có sự tạo dimer giữa các mồi. Cặp mồi khuếch đại đoạn DNA có kích thước 292 bp.

Để kiểm tra xem cặp mồi này có đặc hiệu với N 1 hay không , chúng tôi đã thực hiện Primer- Blast với các trình tự DNA của virus cúm A có trên Genbank. Kết

quả cho thấ y cặp mồi này chỉ khuếch đại đoạn gen NA có kích thước 292 bp của virus cúm A/N1.

Như vậy, sau khi phân tích các trình tự gen H 5, N1 và M của virus cúm A đã công bố trên GenBank bằng các phần mềm chuyên du ̣ng , 3 că ̣p mồi đã được thiết kế để thực hiện phản ứng RT-PCR phát hiê ̣n virus cúm A/H5N1 trong bảng (3.4):

Bảng 3.4: Trình tự các mồi được lựa chọn để thực hiện phản ứng RT-PCR

Tên mồi Trình tự 5’-3’ Vị trí Kích thước (bp) Tm (oC) DiagMF GTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC 5-26 154 55.1 DiagMR GTGACAGGATTGGTCTTGTCTT 158-139 55.8 DiagH5F AGTGATCAGATTTGCATTGGTTAC 46-69 371 54.6 DiagH5R GACCAAGAACTTTTGGGGATG 416-396 55.4 DiagN1F CCAGTTGGTTGACAATTGGAAT 503-524 292 54.5 DiagN1R GCATCAGGATAACAGGAGCA 794-775 55.4

Phân tích đồng thời cả 3 cặp mồi này trên FastPCR 5.4 cho thấy, các cặp mồi có nhiệt độ biến tính (Tm) tương đương nhau, các mồi khơng bắt cặp bổ sung nhau tạo primer – dimer nên không giảm khả năng gắn mồi với gen đích khi tất cả các mồi được cho vào cùng một phản ứng. Và mỗi cặp mồi chỉ đặc hiệu với gen tương ứng và kích thước các đoạn khuếch đại phân biệt nhau trên bản gel điện di nên chúng tôi sử dụng 3 cặp mồi này trong phản ứng multiplex RT-PCR để xây dựng quy trình chẩn đốn cúm A/H5N1.

3.2. Tối ƣu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA 3.2.1 Tối ƣu nhiệt độ gắn mồi 3.2.1 Tối ƣu nhiệt độ gắn mồi

Các phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng rẽ được thực hiện ở các nhiệt độ gắn mồi khác nhau từ 53oC đến 60o

C. Sản phẩm phản ứng (10 µl) được điê ̣n di trên gel agarose 2%, nh ̣m trong dung dịch ethidium bromide 0,5 µg/ml 15 phút, quan sát và chu ̣p ảnh trên hê ̣ thớng chu ̣p ảnh gel để phân tích kết quả. Kết quả điện di (hình 3.4) cho thấy, ở các nhiệt độ gắn mồi khác nhau phản ứng RT-PCR

với từng cặp mồi đều cho kết quả khác nhau. Nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi phát hiện gen M (hình 3.4A) cho băng sản phẩm PCR 154 bp tương đối rõ ở dải nhiệt độ thử nghiệm, tuy nhiên ở 55oC cho tín hiệu band sáng và rõ nét nhất. Trên hình 3.4B cho thấy tín hiệu băng sản phẩm PCR 371 bp phát hiện gen HA mờ và không rõ nét ở nhiệt độ gắn mồi ở 60oC và dưới 55oC; band sáng, rõ nét nhất ở 57oC. Còn trên bản điện di (hình 3.4C) băng phát hiện gen NA có kích thước 292 bp cho tín hiệu sáng và rõ nét nhất ở 57o

C. Từ kết quả của các phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng biệt được thử nghiệm ở các nhiệt độ gắn mồi khác nhau, sản phẩm phản ứng đạt hiệu quả tốt nhất ở nhiệt độ gắn mồi 55oC cho cặp mồi phát hiện gen M và 57oC cho cặp mồi phát gen HA và NA.