Tên mồi Trình tự 5’-3’ Vị trí Kích thước (bp) Tm (oC) DiagMF GTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC 5-26 154 55.1 DiagMR GTGACAGGATTGGTCTTGTCTT 158-139 55.8 DiagH5F AGTGATCAGATTTGCATTGGTTAC 46-69 371 54.6 DiagH5R GACCAAGAACTTTTGGGGATG 416-396 55.4 DiagN1F CCAGTTGGTTGACAATTGGAAT 503-524 292 54.5 DiagN1R GCATCAGGATAACAGGAGCA 794-775 55.4
Phân tích đồng thời cả 3 cặp mồi này trên FastPCR 5.4 cho thấy, các cặp mồi có nhiệt độ biến tính (Tm) tương đương nhau, các mồi khơng bắt cặp bổ sung nhau tạo primer – dimer nên không giảm khả năng gắn mồi với gen đích khi tất cả các mồi được cho vào cùng một phản ứng. Và mỗi cặp mồi chỉ đặc hiệu với gen tương ứng và kích thước các đoạn khuếch đại phân biệt nhau trên bản gel điện di nên chúng tôi sử dụng 3 cặp mồi này trong phản ứng multiplex RT-PCR để xây dựng quy trình chẩn đốn cúm A/H5N1.
3.2. Tối ƣu phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA 3.2.1 Tối ƣu nhiệt độ gắn mồi 3.2.1 Tối ƣu nhiệt độ gắn mồi
Các phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng rẽ được thực hiện ở các nhiệt độ gắn mồi khác nhau từ 53oC đến 60o
C. Sản phẩm phản ứng (10 µl) được điê ̣n di trên gel agarose 2%, nh ̣m trong dung dịch ethidium bromide 0,5 µg/ml 15 phút, quan sát và chu ̣p ảnh trên hê ̣ thống chu ̣p ảnh gel để phân tích kết quả. Kết quả điện di (hình 3.4) cho thấy, ở các nhiệt độ gắn mồi khác nhau phản ứng RT-PCR
với từng cặp mồi đều cho kết quả khác nhau. Nhiệt độ gắn mồi của cặp mồi phát hiện gen M (hình 3.4A) cho băng sản phẩm PCR 154 bp tương đối rõ ở dải nhiệt độ thử nghiệm, tuy nhiên ở 55oC cho tín hiệu band sáng và rõ nét nhất. Trên hình 3.4B cho thấy tín hiệu băng sản phẩm PCR 371 bp phát hiện gen HA mờ và không rõ nét ở nhiệt độ gắn mồi ở 60oC và dưới 55oC; band sáng, rõ nét nhất ở 57oC. Cịn trên bản điện di (hình 3.4C) băng phát hiện gen NA có kích thước 292 bp cho tín hiệu sáng và rõ nét nhất ở 57o
C. Từ kết quả của các phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng biệt được thử nghiệm ở các nhiệt độ gắn mồi khác nhau, sản phẩm phản ứng đạt hiệu quả tốt nhất ở nhiệt độ gắn mồi 55oC cho cặp mồi phát hiện gen M và 57oC cho cặp mồi phát gen HA và NA.
Hình 3.4. Ảnh điện di kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng biệt: (A)- gen M, (B)- gen HA, (C)- gen NA
M: Thang DNA chuẩn 100 bp. Nhiệt độ gắn mồi (oC) được ghi chú phía trên
3.2.2. Tối ƣu nồng độ mồi
Phản ứng RT-PCR cho từng cặp mồi được thử nghiệm ở các nồng độ mồi khác nhau 0.3 µM, 0.4 µM, 0.5 µM, 0.6 µM, 0.7 µM, 0.8 µM và 0.9 µM. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 2% (hình 3.5) cho thấy: ở các nồng độ mồi khác nhau, các phản ứng RT- PCR cho các kết quả khác nhau.
Hình 3.5A: Phản ứng RT-PCR phát hiện gen M ở nồng độ mồi 0.3 µM và 0.4
µM, cho tín hiệu band 154 bp mờ và chưa rõ nét. Ở nồng độ 0.6 µM và 0.7 µM các band sản phẩm RT-PCR rõ nét nhưng xuất hiện băng phụ dimer rõ ở phía dưới. Ở nồng độ mồi 0.5 µM phản ứng cho band sáng rõ nét nhất và band phụ dimer mờ.
Hình 3.5B: Phản ứng RT-PCR phát hiện gen HA, band sản phẩm phản ứng
có kích thước 371 bp có tín hiệu đẹp nhất ở 0.4 µM. Ở nồng độ 0.5 µM band cũng sáng và rõ nhưng band phụ dimer xuất hiện ở dưới nhiều hơn so với ở nồng độ 0.4 µM. Cịn ở các nồng độ mồi khác sản phẩm RT-PCR thấp (các band mờ hơn).
Hình 3.5C: Phản ứng RT-PCR phát hiện gen NA ở nồng độ mồi 0.5 µM cho
Hình 3.5. Ảnh kết quả điện di tối ưu nồng độ mồi cho phản ứng RT-PCR M: Thang DNA chuẩn 100 bp; Nồng độ mồi (µM) được ghi chú ở trên