Thứ tự Nhiê ̣t độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
1 50 30 phút 1 2 95 15 phút 1 3 94 30 giây 40 4 57 30 giây 5 72 30 giây 6 72 5 phút 1
3.3. Tối ƣu phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1
Phản ứng multiplex RT-PCR là một dạng thay đổi của phản ứng RT-PCR, ở đó hai hay hoặc nhiều hơn hai đoạn gen đích được khuếch đại lên đồng thời trong cùng một phản ứng. Việc kết hợp nhiều mồi trong một phản ứng và để nhân lên đồng thời nhiều đoạn gen đích địi hỏi sự thay đổi/tối ưu các thông số của phản ứng.
3.3.1. Tối ƣu nhiệt độ gắn mồi
Việc thay đổi thời gian gắn mồi từ 30 - 60 phút không làm thay đổi nhiều về hiệu quả khuếch đại (không minh hoạ), nhưng nhiệt độ gắn mồi là một trong các thông số quan trọng nhất. Sản phẩm multiplex RT-PCR ở dải nhiệt độ gắn mồi từ 54oC đến 59oC được điện di trên gel agarose 2% (hình 3.8) cho thấy cả 3 đoạn DNA đích đặc hiệu của 3 gen M (154 pb), HA (371 bp) và NA (292 bp) đều được khuếch đại lên đồng thời trong hỗn hợp phản ứng multiplex RT-PCR. Tuy nhiên, ở 57oC cả 3 band đều sáng và rõ nét nhất. Còn ở các nhiệt độ khác 2 band gen M và NA đều sáng và rõ nét nhưng band gen HA lại mờ. Như vậy, ở 57oC là nhiệt độ gắn mồi thích hợp nhất cho cả 3 cặp mồi trong phản ứng multiplex RT-PCR.
Hình 3.8: Ảnh điện di tới ưu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex RT-PCR.
M: thang DNA chuẩn 100 bp. Nhiệt độ gắn mồi (oC) được ghi chú phía trên.
3.3.2. Tối ƣu nồng độ mồi
Để chọn được nồng độ các cặp mồi thích hợp nhất trong cùng phản ứng multiplex RT-PCR, ban đầu chúng tôi thực hiện phản ứng với nồng độ các mồi đã tối ưu ở phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng biệt là 0.5 M (M), 0.4 M
(HA) và 0.5 M (NA). Kết quả, điện di sản phẩm phản ứng trên gel agarose 2%
(hình 3.9A) cho thấy ở nồng độ các mồi này sản phẩm khuếch đại gen M rất cao (band 154 bp sáng và rõ nét) còn sản phẩm khuếch đại gen HA và NA lại rất thấp (band 292 pb và 371 bp mờ và không rõ nét). Nồng độ mồi phát hiện gen NA và HA khơng cịn đặc hiệu trong phản ứng multiplex RT-PCR là do cặp mồi DiagM đặc hiệu hơn và đoạn gen đích của nó ngắn hơn nên khả năng gắn mồi cũng như khả năng ưu tiên hoạt động cho Taq polymerase tốt hơn so với cặp mồi DaigH5 và DiagN1. Căn cứ vào kết quả này, chúng tôi hạ nồng độ gen M, tăng nồng độ gen HA và NA và kết quả điện di (hình 3.9B) cho thấy ở nồng độ gen M, HA và NA lần lượt là 0.3 M, 0.5 M và 0.4 M cho tín hiệu cả 3 band đều sáng và rõ nét nhất.
Hình 3.9. Ảnh điện di tối ưu nồng độ mồi phản ứng multiplex RT-PCR NC: Chứng âm; M: thang DNA chuẩn 100bp;
A: 1: (0.5 M –M, 0.4 M – HA và 0.5 M – NA) B: 2: (0.3 M –M, 0.4 M – HA và 0.5 M – NA)
3: (0.3 M –M, 0.5 M – HA và 0.4 M – NA) 4:(0.5 M –M, 0.5 M – HA và 0.5 M – NA) 5:(0.5 M –M, 0.7 M – HA và 0.6 M – NA)
3.3.3. Tối ƣu thời gian kéo dài chuỗi
Trong phản ứng multiplex RT-PCR, khi nhiều đoạn DNA được nhân lên đồng thời, phần đóng góp của enzyme và các nucleotide trở thành một nhân tố giới hạn và có thể cần phải có nhiều thời gian cho sự trùng hợp các phân tử để hồn
thành q trình tổng hợp của tất cả các sản phẩm. Kết quả điện di sản phẩm phản ứng ở các thời gian kéo dài chuỗi 30 giây, 45 giây và 60 giây (hình 3.10) cho thấy khơng có sự khác biệt nhiều về lượng sản phẩm khuếch đại ở các phản ứng. Để góp phần rút ngắn thời gian làm xét nghiệm, chúng tôi lựa chọn thời gian kéo dài chuỗi thích hợp nhất là 30 giây.
Hình 3.10: Ảnh điện di tối ưu thời gian kéo dài chuỗi phản ứng multiplex RT-PCR M: Thang DNA chuẩn 100 bp; M: Thang DNA chuẩn 100 bp;
Thời gian kéo dài chuỗi (giây) được ghi ở trên
3.3.4. Tối ƣu số chu kỳ phản ứng
Để có số chu kỳ thích hợp cho phản ứng multiplex RT-PCR, chúng tơi kiểm tra số lượng chu kỳ là 35, 40, 45 và 50 chu kỳ. Kết quả điện di (hình 3.11) cho thấy ở 50 chu kỳ sản phẩm phản ứng không thay đổi nhiều so với ở 45 chu kỳ (các band đều sáng và rõ nét). Còn phản ứng thực hiện ở 35 và 40 chu kỳ cho các band mờ hơn rất nhiều. Như vậy, số chu kỳ phản ứng thích hợp là 45 đến 50 chu kỳ hoặc có thể hơn nhưng để rút ngắn thời gian làm xét nghiệm chúng tôi lựa chọn số chu kỳ trong chu trình nhiệt của phản ứng multiplex RT-PCR là 45 chu kỳ.
Hình 3.11: Ảnh điện di tối ưu số chu kỳ phản ứng multiplex RT-PCR M: Thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; Số chu kỳ phản ứng ghi ở trên
3.3.5. Đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex RT-PCR
Phản ứng được th ực hiện với các mẫu chuẩn RNA cúm A /H5N1 có nồng độ khác nhau từ 101 đến 1010 bản sao RNA /µl và sử du ̣ ng 10 µl để điê ̣n di trên gel agarose 2%. Kết quả điê ̣n di trên gel agarose 2%, nhuô ̣m ethidium bromide cho thấy phản ứng dương tính với cúm A/H5N1 tức quan sát được c ả 3 băng DNA có kích thước 154 bp (M), 292 bp (NA) và 371 bp (HA) khi trong mẫu có từ 10/µl bản sao RNA trở lên (hình 3.12).
Hình 3.12: Thử nghiê ̣m đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex RT-PCR M: thang DNA 100 bp; NC: Chứ ng âm; Số lượng bản sao RNA trong mẫu thử được
ghi chú ở phía trên.
3.3.6. Đá nh giá đô ̣ đă ̣c hiê ̣u của phản ƣ́ng multiplex RT-PCR
của phản ứng . Kết quả điện di (hình 3.13) cho thấy phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời cả 3 gen (154 bp - M, 292 bp - NA, 371 bp - HA) với RNA của virus A/H5N1; phát hiện 2 gen (292 bp - NA, 154 bp - M) với RNA virus cúm A/H1N1; phát hiện 2 gen (371 bp - HA; 154 pb - M) với RNA virus cúm A/H5; phát hiện 1 gen (154 bp - M) với RNA virus cúm A/H3 và không phát hiện gen nào với RNA virus cúm B. Ngoài ra, khi thực h iê ̣n phản ứng với vâ ̣t liê ̣u di truyền của mô ̣t số loài khác (người, Escherichia coli, Mycobacteria tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Neisseria gorrnorhea, Hepatitis B virus, Hepatitis C virus, Human immunodeficiency virus, Human Papillomavirus), phản ứng m ultiplex RT-PCR đều
cho kết quả âm tính. Điều đó chứng tỏ với 3 cặp mồi thiết kế và phản ứng multiplex RT-PCR đã tối ưu chỉ đặc hiệu với virus cú m A subtype H5 và subtype N1, khơng có phản ứng chéo với RNA các lồi khác.
Hình 3.13: Ảnh điện di đánh giá độ đặc hiê ̣u của phản ứng multiplexRT-PCR.
M: thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứ ng âm; 1: cúm A/H5; 2: cúm A/H3; 3: cúm B; 4: cúm A/H5N1; 5: cúm A/H1N1
Như vậy sau khi tối ưu, các thành phần và điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng multiplex RT-PCR chẩn đốn cúm A/H5N1 là:
Thành phần phản ứng (bảng 3.12):
Bảng 3.12: Thành phần phản ứng multiplex RT-PCR
Thứ tự Sinh phẩm Thể tích (l) Nồng độ cuối
1 RNase free water 20.75
2 Qiagen Onestep RT-PCR buffer 5X
3 dNTP mix 10 mM each 2 0.4 mM each 4 Diag MF 10 M 1.5 0.3 M Diag MR 10 M 1.5 0.3 M 5 Diag H5F 10 M 2.5 0.5 M Diag H5R 10 M 2.5 0.5 M 6 Diag N1F 10 M 2 0.4 M Diag N1R 10 M 2 0.4 M 7 Qiagen Onestep RT-PCR Enzyme mix 2
8 RNase Inhibitor 40 U/l 0.25 10 U
9 RNA template 5 1 pg – 2 g
Tởng thể tích phản ứng 50
Chu trình nhiệt (bảng 3.13):
Bảng 3.13: Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex RT-PCR
Thứ tự Nhiê ̣t độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
1 50 30 phút 1 2 95 15 phút 1 3 94 30 giây 45 4 57 30 giây 5 72 30 giây 6 72 5 phút 1
3.4. Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1 trên mẫu bệnh phẩm
Các mẫu bệnh phẩm được tiến hành xử lý và tách chiết RNA bằng bộ sinh phẩm QIAamp viral RNA mini spin protocol. Sản phẩm RNA tách chiết được đo OD ở 260 nm và 280 nm để xác định hàm lượng RNA và xác định độ tinh sạch của RNA mẫu bệnh phẩm. Kết quả đo OD cho thấy, tỷ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng 1.8-2.0, RNA tách chiết khơng lẫn protein.
Sau đó, RNA các mẫu bệnh phẩm được sử dụng để thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện cả 3 gen M, HA và NA của virus cúm gia cầm A/H5N1. Đối với các mẫu bệnh phẩm chưa biết chưa biết có nhiễm H5N1 hay không, chúng tôi thực hiện cả phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng rẽ để so sánh và kiểm tra độ tin cậy của phản ứng multiplex RT-PCR.
- Kết quả kỹ thuật multiplex RT-PCR được thử nghiê ̣m trên 14 mẫu dương tính với virus cúm A/H5N1 (2 mẫu từ ngan, 3 mẫu từ vi ̣t, 3 mẫu từ gà, và 6 mẫu từ người) trên bản điện di (hình 3.14) cho thấy phản ứng multiplex RT-PCR đã phát hiê ̣n được virus cúm A/H5N1 trên cả 14 mẫu bê ̣nh phẩm.
Hình 3.14: Kết quả thử nghiê ̣m phản ứng multiplex RT-PCR trên mẫu bê ̣nh phẩm dương tính. M: thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứ ng âm; md: muscovy duck; ck:
chicken; d: duck 1, 2, 3; h: human 1, 2, 3, 4, 5, 6
Qua kết quả này cho thấy, kỹ thuật multiplex RT-PCR đã tối ưu hoá với 3 cặp mồi thiết kế là đặc hiệu và nhạy. Kỹ thuật có thể áp dụng để xác định virus cúm A/H5N1 ở các đối tượng vật chủ khác nhau: gia cầm, người
- Kết quả thử nghiệm kỹ thuật multiplex RT-PCR đã tối ưu phát hiện sự có mặt của virus cúm gia cầm A/H5N1 trên 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm chết và bị bệnh trong các vụ dịch cúm:
Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm A/H5N1 trên gel agarose 2% trên mẫu bệnh phẩm (hình 3.15) cho thấy mẫu chứng âm không bị nhiễm, các mẫu dương tính (số 1, 3, 5, 6, 8 và 9) lên cả 3 band (371 bp- HA, 292 bp- NA, 154 bp- M) tương đương với 3 band của chứng dương. Các mẫu âm tính (số 2, 4, 7 và 10) khơng xuất hiện band nào.
Hình 3.15: Kết quả thử nghiê ̣m phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1 trên một số mẫu bệnh phẩm
M: Thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; PC: Chứng dương; 1-10: Mẫu bệnh phẩm.
Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA trên mẫu bệnh phẩm (hình 3.16) cho thấy: Các mẫu âm tính (khơng xuất hiện band nào) và các mẫu dương tính (xuất hiện 3 band trong 3 phản ứng RT-PCR với từng cặp mồi hình 3.16 A, B, C) cũng là các mẫu âm tính và dương tính trong phản ứng multiplex RT-PCR đã chẩn đốn. Như vậy, có thể khẳng định kết quả phản ứng multiplex RT-PCR là hoàn toàn đáng tin cậy. Và cũng khẳng định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng là không đổi khi kết hợp các mồi trong cùng một phản ứng.
(B)
(C)
Hình 3.16: Kết quả thử nghiê ̣m phản ứng RT-PCR phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1 trên một số mẫu bê ̣nh phẩm. A: RT-PCR phát hiện gen M; B: RT-PCR phát
hiện gen HA; C: RT-PCR phát hiện gen NA
M: Thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; PC: Chứng dương; 1- 10: Mẫu bệnh phẩm.
Trong 30 mẫu bệnh phẩm chúng tôi thử nghiệm, kỹ thuật multiplex RT-PCR và RT-PCR phát hiện được 9 mẫu dương tính (30%) với virus cúm gia cầm A/H5N1, 21 mẫu âm tính (70%) với virus cúm gia cầm (bảng 3.14). Kết quả kỹ thuật multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời cả 3 gen có độ nhạy và độ đặc hiệu không thay đổi so với phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng biệt. Độ đặc hiệu của phản ứng là 100%, độ nhạy cao, có thể phát hiện khi trong phản ứng có từ 10 bản sao virus trở lên.
Bảng 3.14: So sánh kết quả xét nghiệm phản ứng RT-PCR và multiplex RT- PCR trên mẫu bệnh phẩm
Kỹ thuât xét nghiệm Dương tính Âm tính Tổng
Multiplex RT-PCR 9 21 30
RT-PCR 9 21 30
So sánh về thời gian và chi phí làm xét nghiệm giữa 2 kỹ thuật multiplex RT- PCR và RT-PCR phát hiện virus cúm A/H5N1 (bảng 3.15) cho thấy: thời gian hoàn thành xét nghiệm với phản ứng RT-PCR là khoảng 9.5 giờ, chi phí hết 600 ngàn đồng; thời gian hoàn thành xét nghiệm với phản ứng multiplex RT-PCR là khoảng 6.5 giờ, chi phí hết 320 ngàn đồng. Như vậy, phản ứng multiplex RT-PCR rút ngắn thời gian làm xét nghiệm và tích kiệm chi phí hố chất đến một nửa so với phản ứng RT-PCR.
Bảng 3.15: So sánh thời gian và chi phí hố chất làm xét nghiệm giữa phản ứng multiplex RT-PCR và RT-PCR
Xét nghiệm Các bƣớc làm xét nghiệm Thời gian (giờ)
Chi phí (ngàn đồng) RT-PCR Xử lý mẫu và tách chiết RNA 2 150
Thực hiện 3 phản ứng Qiagen Onestep RT-PCR
6 420
Điện di gel agarose, nhuộm, quan sát 1.5 30
Tổng 9.5 600
Multiplex RT-PCR
Xử lý mẫu và tách chiết RNA 2 150
Thực hiện 1 phản ứng Qiagen Onestep RT-PCR
3 140
Điện di gel agarose, nhuộm, quan sát 1.5 30
Tổng 6.5 320
Thảo luận
Trong những năm gần đây, dịch cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 đã xảy ra ở nhiều nước, đă ̣c biê ̣t là các nước trong khu vực Đông Nam Á. Không chỉ gây bê ̣nh trên gia cầm, virus cúm A/H5N1 còn lây nhiễm và gây bệnh trên người với tỉ lệ tử vong rất cao. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam là nước có số người tử vong do cúm A/H5N1 đứ ng thứ 2 trên thế giới, sau Indonesia. Ở nước ta, dịch cúm gia cầm A/H5N1 vẫn đang xảy ra và có thể bùng phát bất cứ lúc nào . Khi dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát, việc điều trị, kiểm soát và ngăn chặn khẩn cấp dịch cúm lan rộng là vô cùng quan trọng. Do đó , viê ̣c xây dựng mô ̣t kỹ thuâ ̣t chẩn đoán nh anh, nhạy và chính xác virus cú m A/H5N1 là hết sức cấp thiết để sàng lọc số lượng lớn loại virus này. Trong các kỹ thuật phân tử chẩn đoán virus cúm, phản ứng multiplex RT-PCR được xem là
xét nghiệm (Ellis et al., 1997; Fan et al., 1998; Osiowy, 1998; Grondahl et al., 1999; Liolios et al., 2001; Xie et al., 2006; Bellau-Pojul et al., 2005 and Thontiravong et al., 2007).
Trong nghiên cứu của chúng tôi, kỹ thuật multiplex RT-PCR với 3 că ̣p mồi cho phép phát hiê ̣n đờng thời cả 3 trình tự đặc hiệu của vir us cúm A (trên gen M ), subtype H 5 (trên gen HA ) và subtype N1 (trên gen NA) đã đươ ̣c xây dựng thành công. Kỹ thuật multiplex RT-PCR được thực hiện theo phương pháp một bước (phản ứng phiên mã ngược và phản ứng khuếch đại được thực hiện trong cùng một tube phản ứng) nên giảm thiểu tối đa nguy cơ ngoại nhiễm. Mặt khác, thời gian làm xét nghiệm cũng được giảm đáng kể so với phương pháp hai bước (phản ứng RT và PCR thực hiện trong 2 tube riêng biệt) và kỹ thuật RT-PCR phát hiện từng gen riêng biệt. Kết quả thử nghiê ̣m cho thấy kỹ thuâ ̣t multiplex RT-PCR chỉ đă ̣c hiê ̣u với virus cúm A/H5N1 và có độ nhạy cao , có khả năng phát hiện khi trong mẫu thử có từ 10 bản sao virus trở lên. So với kỹ thuật RT-PCR phát hiện từng gen riêng biệt, đô nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng multiplex không bị giảm. Thử nghiê ̣m trên 14 mẫu bê ̣nh phẩm dương tính với virus cúm A /H5N1 (8 mẫu thu thâ ̣p từ gia cầm và 6 mẫu từ người), phản ứng m ultiplex RT-PCR đều khuếch đa ̣i thành công gen H 5, N1 và M củ a virus . Như vâ ̣y , kỹ thuật này có thể ứng dụng để phát hiện nhiễm cúm A/H5N1 trên cả người và gia cầm . Các cặp mồi thiết kế đặc hiệu với gen M, HA và NA của các chủng virus cúm phân lập từ các vật chủ khác nhau nên kỹ thuật multiplex RT-PCR cịn có thể dùng để phát hiện nhiễm cúm A/H5N1 ở một số động vật có vú khác.
Kỹ thuật multiplex RT-PCR đươ ̣c thiết kế với 3 că ̣p mồi có những ưu điểm vượt trô ̣i như: đơn giản hóa các bước trong quá trình xét nghiê ̣m , giảm thời gian làm xét nghiê ̣m và tiết kiê ̣m được khoảng 50% chi phí hóa chất phu ̣c vu ̣ cho xét nghiê ̣m. Tuy