Thời gian kéo dài chuỗi (giây) được ghi ở trên
3.3.4. Tối ƣu số chu kỳ phản ứng
Để có số chu kỳ thích hợp cho phản ứng multiplex RT-PCR, chúng tơi kiểm tra số lượng chu kỳ là 35, 40, 45 và 50 chu kỳ. Kết quả điện di (hình 3.11) cho thấy ở 50 chu kỳ sản phẩm phản ứng không thay đổi nhiều so với ở 45 chu kỳ (các band đều sáng và rõ nét). Còn phản ứng thực hiện ở 35 và 40 chu kỳ cho các band mờ hơn rất nhiều. Như vậy, số chu kỳ phản ứng thích hợp là 45 đến 50 chu kỳ hoặc có thể hơn nhưng để rút ngắn thời gian làm xét nghiệm chúng tôi lựa chọn số chu kỳ trong chu trình nhiệt của phản ứng multiplex RT-PCR là 45 chu kỳ.
Hình 3.11: Ảnh điện di tối ưu số chu kỳ phản ứng multiplex RT-PCR M: Thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; Số chu kỳ phản ứng ghi ở trên
3.3.5. Đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex RT-PCR
Phản ứng được th ực hiện với các mẫu chuẩn RNA cúm A /H5N1 có nồng độ khác nhau từ 101 đến 1010 bản sao RNA /µl và sử du ̣ ng 10 µl để điê ̣n di trên gel agarose 2%. Kết quả điê ̣n di trên gel agarose 2%, nhuô ̣m ethidium bromide cho thấy phản ứng dương tính với cúm A/H5N1 tức quan sát được c ả 3 băng DNA có kích thước 154 bp (M), 292 bp (NA) và 371 bp (HA) khi trong mẫu có từ 10/µl bản sao RNA trở lên (hình 3.12).
Hình 3.12: Thử nghiê ̣m đánh giá độ nhạy của phản ứng multiplex RT-PCR M: thang DNA 100 bp; NC: Chứ ng âm; Số lượng bản sao RNA trong mẫu thử được
ghi chú ở phía trên.
3.3.6. Đá nh giá đô ̣ đă ̣c hiê ̣u của phản ƣ́ng multiplex RT-PCR
của phản ứng . Kết quả điện di (hình 3.13) cho thấy phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời cả 3 gen (154 bp - M, 292 bp - NA, 371 bp - HA) với RNA của virus A/H5N1; phát hiện 2 gen (292 bp - NA, 154 bp - M) với RNA virus cúm A/H1N1; phát hiện 2 gen (371 bp - HA; 154 pb - M) với RNA virus cúm A/H5; phát hiện 1 gen (154 bp - M) với RNA virus cúm A/H3 và không phát hiện gen nào với RNA virus cúm B. Ngoài ra, khi thực h iê ̣n phản ứng với vâ ̣t liê ̣u di truyền của mô ̣t số loài khác (người, Escherichia coli, Mycobacteria tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Neisseria gorrnorhea, Hepatitis B virus, Hepatitis C virus, Human immunodeficiency virus, Human Papillomavirus), phản ứng m ultiplex RT-PCR đều
cho kết quả âm tính. Điều đó chứng tỏ với 3 cặp mồi thiết kế và phản ứng multiplex RT-PCR đã tối ưu chỉ đặc hiệu với virus cú m A subtype H5 và subtype N1, khơng có phản ứng chéo với RNA các lồi khác.
Hình 3.13: Ảnh điện di đánh giá độ đặc hiê ̣u của phản ứng multiplexRT-PCR.
M: thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứ ng âm; 1: cúm A/H5; 2: cúm A/H3; 3: cúm B; 4: cúm A/H5N1; 5: cúm A/H1N1
Như vậy sau khi tối ưu, các thành phần và điều kiện chu trình nhiệt của phản ứng multiplex RT-PCR chẩn đoán cúm A/H5N1 là:
Thành phần phản ứng (bảng 3.12):
Bảng 3.12: Thành phần phản ứng multiplex RT-PCR
Thứ tự Sinh phẩm Thể tích (l) Nồng độ cuối
1 RNase free water 20.75
2 Qiagen Onestep RT-PCR buffer 5X
3 dNTP mix 10 mM each 2 0.4 mM each 4 Diag MF 10 M 1.5 0.3 M Diag MR 10 M 1.5 0.3 M 5 Diag H5F 10 M 2.5 0.5 M Diag H5R 10 M 2.5 0.5 M 6 Diag N1F 10 M 2 0.4 M Diag N1R 10 M 2 0.4 M 7 Qiagen Onestep RT-PCR Enzyme mix 2
8 RNase Inhibitor 40 U/l 0.25 10 U
9 RNA template 5 1 pg – 2 g
Tởng thể tích phản ứng 50
Chu trình nhiệt (bảng 3.13):
Bảng 3.13: Chu trình nhiệt của phản ứng multiplex RT-PCR
Thứ tự Nhiê ̣t độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
1 50 30 phút 1 2 95 15 phút 1 3 94 30 giây 45 4 57 30 giây 5 72 30 giây 6 72 5 phút 1
3.4. Ứng dụng kỹ thuật multiplex RT-PCR phát hiện virus A/H5N1 trên mẫu bệnh phẩm
Các mẫu bệnh phẩm được tiến hành xử lý và tách chiết RNA bằng bộ sinh phẩm QIAamp viral RNA mini spin protocol. Sản phẩm RNA tách chiết được đo OD ở 260 nm và 280 nm để xác định hàm lượng RNA và xác định độ tinh sạch của RNA mẫu bệnh phẩm. Kết quả đo OD cho thấy, tỷ lệ OD260/OD280 nằm trong khoảng 1.8-2.0, RNA tách chiết khơng lẫn protein.
Sau đó, RNA các mẫu bệnh phẩm được sử dụng để thực hiện phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện cả 3 gen M, HA và NA của virus cúm gia cầm A/H5N1. Đối với các mẫu bệnh phẩm chưa biết chưa biết có nhiễm H5N1 hay không, chúng tôi thực hiện cả phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng rẽ để so sánh và kiểm tra độ tin cậy của phản ứng multiplex RT-PCR.
- Kết quả kỹ thuật multiplex RT-PCR được thử nghiê ̣m trên 14 mẫu dương tính với virus cúm A/H5N1 (2 mẫu từ ngan, 3 mẫu từ vi ̣t, 3 mẫu từ gà, và 6 mẫu từ người) trên bản điện di (hình 3.14) cho thấy phản ứng multiplex RT-PCR đã phát hiê ̣n được virus cúm A/H5N1 trên cả 14 mẫu bê ̣nh phẩm.
Hình 3.14: Kết quả thử nghiê ̣m phản ứng multiplex RT-PCR trên mẫu bê ̣nh phẩm dương tính. M: thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứ ng âm; md: muscovy duck; ck:
chicken; d: duck 1, 2, 3; h: human 1, 2, 3, 4, 5, 6
Qua kết quả này cho thấy, kỹ thuật multiplex RT-PCR đã tối ưu hoá với 3 cặp mồi thiết kế là đặc hiệu và nhạy. Kỹ thuật có thể áp dụng để xác định virus cúm A/H5N1 ở các đối tượng vật chủ khác nhau: gia cầm, người
- Kết quả thử nghiệm kỹ thuật multiplex RT-PCR đã tối ưu phát hiện sự có mặt của virus cúm gia cầm A/H5N1 trên 30 mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm chết và bị bệnh trong các vụ dịch cúm:
Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm A/H5N1 trên gel agarose 2% trên mẫu bệnh phẩm (hình 3.15) cho thấy mẫu chứng âm khơng bị nhiễm, các mẫu dương tính (số 1, 3, 5, 6, 8 và 9) lên cả 3 band (371 bp- HA, 292 bp- NA, 154 bp- M) tương đương với 3 band của chứng dương. Các mẫu âm tính (số 2, 4, 7 và 10) không xuất hiện band nào.
Hình 3.15: Kết quả thử nghiê ̣m phản ứng multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1 trên một số mẫu bệnh phẩm
M: Thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; PC: Chứng dương; 1-10: Mẫu bệnh phẩm.
Kết quả điện di sản phẩm phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen M, HA và NA trên mẫu bệnh phẩm (hình 3.16) cho thấy: Các mẫu âm tính (khơng xuất hiện band nào) và các mẫu dương tính (xuất hiện 3 band trong 3 phản ứng RT-PCR với từng cặp mồi hình 3.16 A, B, C) cũng là các mẫu âm tính và dương tính trong phản ứng multiplex RT-PCR đã chẩn đốn. Như vậy, có thể khẳng định kết quả phản ứng multiplex RT-PCR là hoàn toàn đáng tin cậy. Và cũng khẳng định độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng là không đổi khi kết hợp các mồi trong cùng một phản ứng.
(B)
(C)
Hình 3.16: Kết quả thử nghiê ̣m phản ứng RT-PCR phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1 trên một số mẫu bê ̣nh phẩm. A: RT-PCR phát hiện gen M; B: RT-PCR phát
hiện gen HA; C: RT-PCR phát hiện gen NA
M: Thang DNA chuẩn 100 bp; NC: Chứng âm; PC: Chứng dương; 1- 10: Mẫu bệnh phẩm.
Trong 30 mẫu bệnh phẩm chúng tôi thử nghiệm, kỹ thuật multiplex RT-PCR và RT-PCR phát hiện được 9 mẫu dương tính (30%) với virus cúm gia cầm A/H5N1, 21 mẫu âm tính (70%) với virus cúm gia cầm (bảng 3.14). Kết quả kỹ thuật multiplex RT-PCR phát hiện đồng thời cả 3 gen có độ nhạy và độ đặc hiệu không thay đổi so với phản ứng RT-PCR phát hiện từng gen riêng biệt. Độ đặc hiệu của phản ứng là 100%, độ nhạy cao, có thể phát hiện khi trong phản ứng có từ 10 bản sao virus trở lên.
Bảng 3.14: So sánh kết quả xét nghiệm phản ứng RT-PCR và multiplex RT- PCR trên mẫu bệnh phẩm
Kỹ thuât xét nghiệm Dương tính Âm tính Tổng
Multiplex RT-PCR 9 21 30
RT-PCR 9 21 30
So sánh về thời gian và chi phí làm xét nghiệm giữa 2 kỹ thuật multiplex RT- PCR và RT-PCR phát hiện virus cúm A/H5N1 (bảng 3.15) cho thấy: thời gian hoàn thành xét nghiệm với phản ứng RT-PCR là khoảng 9.5 giờ, chi phí hết 600 ngàn đồng; thời gian hồn thành xét nghiệm với phản ứng multiplex RT-PCR là khoảng 6.5 giờ, chi phí hết 320 ngàn đồng. Như vậy, phản ứng multiplex RT-PCR rút ngắn thời gian làm xét nghiệm và tích kiệm chi phí hố chất đến một nửa so với phản ứng RT-PCR.
Bảng 3.15: So sánh thời gian và chi phí hố chất làm xét nghiệm giữa phản ứng multiplex RT-PCR và RT-PCR
Xét nghiệm Các bƣớc làm xét nghiệm Thời gian (giờ)
Chi phí (ngàn đồng) RT-PCR Xử lý mẫu và tách chiết RNA 2 150
Thực hiện 3 phản ứng Qiagen Onestep RT-PCR
6 420
Điện di gel agarose, nhuộm, quan sát 1.5 30
Tổng 9.5 600
Multiplex RT-PCR
Xử lý mẫu và tách chiết RNA 2 150
Thực hiện 1 phản ứng Qiagen Onestep RT-PCR
3 140
Điện di gel agarose, nhuộm, quan sát 1.5 30
Tổng 6.5 320
Thảo luận
Trong những năm gần đây, dịch cúm gia cầm do virus cúm A/H5N1 đã xảy ra ở nhiều nước, đă ̣c biê ̣t là các nước trong khu vực Đông Nam Á. Không chỉ gây bê ̣nh trên gia cầm, virus cúm A/H5N1 còn lây nhiễm và gây bệnh trên người với tỉ lệ tử vong rất cao. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, Việt Nam là nước có số người tử vong do cúm A/H5N1 đứ ng thứ 2 trên thế giới, sau Indonesia. Ở nước ta, dịch cúm gia cầm A/H5N1 vẫn đang xảy ra và có thể bùng phát bất cứ lúc nào . Khi dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát, việc điều trị, kiểm soát và ngăn chặn khẩn cấp dịch cúm lan rộng là vô cùng quan trọng. Do đó , viê ̣c xây dựng mô ̣t kỹ thuâ ̣t chẩn đoán nh anh, nhạy và chính xác virus cú m A/H5N1 là hết sức cấp thiết để sàng lọc số lượng lớn loại virus này. Trong các kỹ thuật phân tử chẩn đoán virus cúm, phản ứng multiplex RT-PCR được xem là
xét nghiệm (Ellis et al., 1997; Fan et al., 1998; Osiowy, 1998; Grondahl et al., 1999; Liolios et al., 2001; Xie et al., 2006; Bellau-Pojul et al., 2005 and Thontiravong et al., 2007).
Trong nghiên cứu của chúng tôi, kỹ thuật multiplex RT-PCR với 3 că ̣p mồi cho phép phát hiê ̣n đồng thời cả 3 trình tự đặc hiệu của vir us cúm A (trên gen M ), subtype H 5 (trên gen HA ) và subtype N1 (trên gen NA) đã đươ ̣c xây dựng thành công. Kỹ thuật multiplex RT-PCR được thực hiện theo phương pháp một bước (phản ứng phiên mã ngược và phản ứng khuếch đại được thực hiện trong cùng một tube phản ứng) nên giảm thiểu tối đa nguy cơ ngoại nhiễm. Mặt khác, thời gian làm xét nghiệm cũng được giảm đáng kể so với phương pháp hai bước (phản ứng RT và PCR thực hiện trong 2 tube riêng biệt) và kỹ thuật RT-PCR phát hiện từng gen riêng biệt. Kết quả thử nghiê ̣m cho thấy kỹ thuâ ̣t multiplex RT-PCR chỉ đă ̣c hiê ̣u với virus cúm A/H5N1 và có độ nhạy cao , có khả năng phát hiện khi trong mẫu thử có từ 10 bản sao virus trở lên. So với kỹ thuật RT-PCR phát hiện từng gen riêng biệt, đô nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng multiplex không bị giảm. Thử nghiê ̣m trên 14 mẫu bê ̣nh phẩm dương tính với virus cúm A /H5N1 (8 mẫu thu thâ ̣p từ gia cầm và 6 mẫu từ người), phản ứng m ultiplex RT-PCR đều khuếch đa ̣i thành công gen H 5, N1 và M củ a virus . Như vâ ̣y , kỹ thuật này có thể ứng dụng để phát hiện nhiễm cúm A/H5N1 trên cả người và gia cầm . Các cặp mồi thiết kế đặc hiệu với gen M, HA và NA của các chủng virus cúm phân lập từ các vật chủ khác nhau nên kỹ thuật multiplex RT-PCR cịn có thể dùng để phát hiện nhiễm cúm A/H5N1 ở một số động vật có vú khác.
Kỹ thuật multiplex RT-PCR đươ ̣c thiết kế với 3 că ̣p mồi có những ưu điểm vượt trô ̣i như: đơn giản hóa các bước trong quá trình xét nghiê ̣m , giảm thời gian làm xét nghiê ̣m và tiết kiê ̣m được khoảng 50% chi phí hóa chất phu ̣c vu ̣ cho xét nghiê ̣m. Tuy phản ứng multiplex realtime RT-PCR cho kết quả nhanh, nhạy và chính xác nhưng u cầu có máy móc hiện đại và chi phí tốn kém. Do vậy, kỹ thuật multiplex RT-PCR chúng tôi xây dựng này là thuận tiện cho nhiều phịng thí nghiệm như trong nước ta hiện nay.
Kết luận
1. Đã thiết kế được 3 cặp mồi đặc hiệu với 3 gen M, HA và NA dùng để phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1 trong mẫu bệnh phẩm bằng phản ứng mutiplex RT-PCR.
2. Đã xây dựng thành công kỹ thuâ ̣t m ultiplex RT-PCR cho phép phát hiê ̣n nhanh virus cúm A/H5N1 với đô ̣ nha ̣y và đô ̣ đă ̣c hiê ̣u cao và có thể áp du ̣ng để phát hiê ̣n nhiễm cúm A/H5N1 ở gia cầm và người.
3. Kỹ thuật m ultiplex RT-PCR chỉ đă ̣c hiê ̣u với virus cúm A /H5N1, không có phản ứng chéo với các loài khác . Kỹ thuật có khả năng phát hiện khi trong mẫ u thử có từ 10 bản sao RNA trở lên.
Kiến nghị
Để tiếp tục phát triển các kết quả nghiên cứu vào xét nghiệm cúm A/H5N1 trên mẫu bệnh phẩm gia cầm và người, chúng tôi đề xuất kiến nghị như sau:
1. Tiếp tục nghiên cứu ứng dụng quy trình phản ứng multiplex RT-PCR này vào phát hiện virus cúm A/H5N1 trên số lượng lớn mẫu bệnh phẩm thu thập từ gia cầm và người bị bệnh trong các vụ dịch cúm.
2. Ứng dụng quy trình multiplex RT-PCR phát hiện virus cúm A/H5N1 trong các mẫu thu thập từ gia cầm khoẻ mạnh và mơi trường nơi đã có dịch cúm xảy ra để đánh giá sự lưu hành của virus cúm gia cầm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bùi Quang Anh (2006), Báo cáo tình hình cúm gia cầm tại Việt Nam, Hội nghị phòng chống dịch cúm gia cầm do Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn.
2. Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Trần Bình (2004), “Virus cúm A của gia cầm và mối quan hệ lây nhiễm động vật sang người”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 2(1): 1-18.
3. Lê Văn Năm (2004), “Bệnh cúm gà”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(1): 81-86.
4. Tô Long Thành (2004), “Bệnh cúm lồi chim”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(2): 53-58.
Tiếng Anh
5. Abdel-Ghafar AN, Chotpitayasunondh T, Gao Z, Hayden FG, Nguyen DH, et al, 2008, “Update on avian influenza A (H5N1) virus infection in humans”, N. Engl. J. Med, 358, pp. 261-73.
6. Apisarnthanarak A, Kitphati R, Thongphubeth K, Patoomanunt P, et al, 2004, “Atypical avian influenza (H5N1)”, Emerg Infect Dis, 10, pp. 1321- 4.
7. Baigent SJ, McCauley JW (2001), “Glycosylation of haemagglutinin and stalk- length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture” Virus Res, 79(1-2): 177-185.
8. Beare AS and Webster RG (1991), “Replication of avian influenza viruses in humans”, Arch. Virol., 119, pp. 37-42.
9. Beigel JH, Farrar J, Han AM, Hayden FG, Hyer R, de Jong MD, Lochindarat S, Nguyen TK, Nguyen TH, Tran TH, Nicoll A, Touch S, Yuen KY (2005), “Avian influenza A (H5N1) infection in humans”, N Engl J Med, 353, pp.
1374- 85.
10. Bloomberg News articles (2006), Two Bird Flu Gene Mutations Might Lead to
Faster Human Spread, Published.
11. Butler D. (2006), “Alarms ring over bird flu mutations”, Nature, 439, pp. 248-9 12. CDC (2009), Interim guidance on the planning for the use of surgical masks
13. Chan PK (2002), “Outbreak of avian influenza A (H5N1) virus infection in Hong Kong in 1997”, Clin Infect Dis, 34(suppl 2):S58- S64.
14. Chen H, Smith GJ, Li KS, Wang J, Fan XH, et al (2006), “Establishment of multiple sublineages of H5N1 influenza virus in Asia: implications for pandemic control”, Proc Natl Acad Sci USA, 103, pp. 2845- 50.
15. Chen, H., G. Deng, Z. Li, G. Tian, Y. Li, and P. Jiao (2004), “The evolution