CHƢƠNG 2 : ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.5. Tạo mẫu chuẩn cho kỹ thuật định lượng PCR
Mẫu chuẩn sử dụng trong nghiên cứu là hỗn hợp DNA có tỷ lệ methyl hóa gen
SHOX2 đã biết, đƣợc tạo ra bằng cách phối trộn plasmid (Me-Shox) chứa trình tự
gen SHOX2 sau xử lý bị methyl hóa với plasmid (Un-Shox) chứa trình tự gen
SHOX2 sau xử lý khơng bị methyl hóa và 10 ng DNA tổng số trƣớc xử lý tách từ mẫu máu ngƣời bình thƣờng. Một điểm cần lƣu ý là các plasmid đƣợc sử dụng để tạo mẫu chuẩn phải ở dạng thẳng do hiệu quả gắn mồi và hiệu suất kéo dài của phản ứng PCR đối với các plasmid dạng thẳng cao hơn dạng siêu xoắn hoặc dạng tròn [32].
2.4.5.1. Tạo plasmid dạng thẳng từ dạng tròn
Dạng thẳng của hai plasmid (Me-Shox và Un-Shox) chứa trình tự gen SHOX2 bị methyl hóa và khơng bị methyl hóa đƣợc thu nhận bằng hai phƣơng pháp:
- Cắt plasmid với enzyme giới hạn: plasmid đƣợc xử lý với enzyme giới hạn
ScaI để đƣa về dạng thẳng. Thành phần và điều kiện phản ứng cắt đƣợc trình bày
trong Bảng 2.5.
Bảng 2.5: Thành phần và điều kiện phản ứng cắt plasmid
Thành phần Thể tích (µl) 10x Buffer 10,0 ScaI (20 u/µl) 5,0 Plasmid dạng trịn (~ 200 ng/µl) 5,0 Thêm nƣớc cho đủ 100,0 Ủ 37 oC trong 1 giờ.
- PCR đảo (Inverse PCR) với cặp mồi đặc hiệu để tạo plasmid dạng thẳng
Phƣơng pháp PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu ScaI-F/ScaI-R để khuếch đại tồn bộ trình tự plasmid (Hình 2.1). Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đƣợc trình bày trong Bảng 2.6.
Bảng 2.6: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đảo tổng hợp plasmid dạng thẳng
Thành phần Thể tích (µl)
5x Ultra Buffer 10,0
ScaI F 10 µM 2,0
ScaI R 10 µM 2,0
Ultra Taq DNA polymerase (5 u/µl) 0,5
Plasmid dạng trịn (100 pg/µl) 3,0
Thêm nƣớc cho đủ 50,0
Điều kiện: 95 o
C 1 phút; (95 oC 15 giây; 62 oC 15 giây; 72 oC 45 giây)x35 chu kỳ; 72 oC 5 phút; giữ nhiệt ở 20 oC
2.4.5.2. Tinh sạch plasmid dạng thẳng
Sản phẩm xử lý với enzyme giới hạn và sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch theo hƣớng dẫn của kit PureLink® Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo Kit- Invitrogen (Phụ lục 9) và đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1%.
2.4.5.3. Pha loãng và phối trộn các plasmid để tạo mẫu chuẩn
Các plasmid sau khi tinh sạch sẽ đƣợc đƣa về nồng độ 109 copies/µl theo cơng thức:
Sau đó, plasmid chứa trình tự gen SHOX2 khơng bị methyl hóa (Un-Shox) sẽ
đƣợc pha lỗng về nồng độ 104 copies/µl và đƣợc trộn với plasmid chứa trình tự gen
SHOX2 bị methyl hóa (Me-Shox) ở các nồng độ 104, 5x103, 103, 500, 50, 10 copies/µl cùng với 10 ng DNA tổng số trƣớc xử lý tách từ mẫu máu ngƣời bình thƣờng để lần lƣợt tạo ra các mẫu chuẩn có tỷ lệ Me-Shox : Un-Shox là 1:1, 1:2, 1:10, 1:20, 1:200, 1:1000 (Bảng 2.7). Các mẫu này sẽ đƣợc sử dụng để xây dựng đƣờng chuẩn nhằm kiểm tra thao tác, hiệu suất phản ứng và tính tốn tỷ lệ methyl hóa của các mẫu bệnh phẩm.
Bảng 2.7: Tỷ lệ phối trộn các plasmid để tạo mẫu chuẩn Un-Shox (copies/µl) 104 104 104 104 104 104 Me-Shox (copies/µl) 104 5x103 103 500 50 10 DNA tổng số (ng) 10 10 10 10 10 10 Mẫu chuẩn (tỉ lệ Me-Shox: Un-Shox) 1:1 1:2 1:10 1:20 1:200 1:1000 2.4.6. Định lượng PCR (Realtime PCR)
Trong nghiên cứu của chúng tơi, tỷ lệ methyl hố gen SHOX2 đƣợc định lƣợng tƣơng đối sử dụng phƣơng pháp ΔΔCt [46]. Việc tính tốn đƣợc thực hiện nhƣ sau:
ΔΔCt = ΔCt (Mẫu bệnh phẩm) – ΔCt (Mẫu chuẩn). Trong đó:
ΔCt (Mẫu bệnh phẩm) = Ct (Mẫu bệnh phẩm/Me-SHOX2) – Ct (Mẫu bệnh phẩm/ Un-SHOX2)
ΔCt (Mẫu chuẩn) = Ct (Mẫu chuẩn/Me-SHOX2) – Ct (Mẫu chuẩn/Un-SHOX2) Phần trăm methyl hóa của mẫu bệnh phẩm đƣợc tính theo mẫu chuẩn nhƣ sau:
% Methyl hóa mẫu bệnh phẩm = % methyl hóa mẫu chuẩn x 2-ΔΔCt
Thành phần của phản ứng real-time PCR và điều kiện tối ƣu cho hai cặp mồi đảm bảo khơng có sản phẩm phụ thơng qua phân tích đƣờng cong nóng chảy (Melting curve) (Phụ lục 5) đƣợc trình bày ở Bảng 2.8.
Bảng 2.8: Thành phần và điều kiện tối ƣu của các phản ứng realtime PCR với các cặp mồi
Un-SHOX2-F/R và Me-SHOX2-F/R
Un-SHOX2-F/R Me-SHOX2-F/R
Thành phần Thể tích (µl) Thành phần Thể tích (µl)
2x qPCR Master Mix 10,0 2x qPCR Master Mix 10,0
Un-SHOX2-F 10 µM 0,3 Me-SHOX2-F 10 µM 0,3
Un-SHOX2-R 10 µM 0,3 Me-SHOX2-R 10 µM 0,3
DNA 3,0 DNA 3,0
Thêm nƣớc cho đủ 20,0 Thêm nƣớc cho đủ 20,0
Điều kiện: 95 o
C 10 phút; (95 oC 30 giây; 64 oC 30 giây; 72 oC 30 giây)x40 chu kỳ (đọc tín hiệu ở 72 o
C)
2.4.7. Phương pháp phân tích thống kê
Giá trị của một dấu chuẩn đƣợc xác định bằng độ nhạy và độ đặc hiệu. Trong nghiên cứu này, độ nhạy (Se) là tỷ lệ các mẫu có kết quả dƣơng tính ung thƣ phổi (mẫu dƣơng tính thật – TP) trên tổng số các mẫu ung thƣ phổi (gồm mẫu dƣơng tính thật và mẫu âm tính giả – TP + FN) [24]:
Độ đặc hiệu (Sp) là tỷ lệ các mẫu có kết quả âm tính ung thƣ phổi (mẫu âm tính thật – TN) trên tổng số các mẫu bình thƣờng, mẫu phổi lành tính hoặc các mẫu ung thƣ khác (gồm mẫu âm tính thật và mẫu dƣơng tính giả – TN + FP) [24]:
Để đánh giá hiệu quả của một xét nghiệm chẩn đoán, ngƣời ta sẽ xây dựng đồ thị đƣờng cong ROC (Receiver Operating Characteristic – ROC). Trong đó trục tung của đồ thị biểu diễn giá trị độ nhạy và trục hoành biểu diễn giá trị (1- độ đặc
hiệu) [57]. Diện tích dƣới đƣờng cong (Area Under the Curve – AUC) của đồ thị ROC là thƣớc đo độ chính xác của xét nghiệm chẩn đốn và đƣợc tính trực tiếp từ dữ liệu thơ sử dụng tiêu chuẩn phi tham số Wilcoson-Mann-Whitney cho mẫu không phân phối chuẩn. AUC đƣợc báo cáo với 95% khoảng tin cậy (95% CI). Giá trị AUC nằm trong khoảng từ 0 – 1. Giá trị này càng gần 1 thì xét nghiệm chẩn đốn càng chính xác [57].
Do methyl hóa SHOX2 khơng chỉ xảy ra với bệnh nhân ung thƣ phổi mà còn
xảy ra ở ngƣời bình thƣờng hoặc bệnh nhân mắc bệnh phổi lành tính [16,34,39,61] nên cần xác định giá trị cut-off để xây dựng ranh giới phân biệt trƣờng hợp âm tính và dƣơng tính. Các mẫu có tỷ lệ methyl hóa lớn hơn cut-off đƣợc coi là dƣơng tính, ngƣợc lại là âm tính. Có nhiều phƣơng pháp khác nhau để xác định giá trị cut-off, nhƣ sử dụng chỉ số Youden (J) và chọn điểm cut-off sao cho chỉ số này là lớn nhất [5]:
J = (Se + Sp - 1)
Trong đó:
Se: độ nhạy; Sp: độ đặc hiệu
Trong hầu hết các nghiên cứu, giá trị cut-off sẽ đƣợc chọn sao cho tỷ lệ dƣơng tính giả nhỏ hơn hoặc bằng 5% cho nhóm đối chứng. Chúng tơi chọn giá trị cut-off theo cách này.
Kiểm định phi tham số Mann-Whitney cho mẫu không phân phối chuẩn đƣợc sử dụng để so sánh mức độ methyl hóa SHOX2 giữa nhóm ung thƣ phổi và nhóm
đối chứng. Mối liên hệ giữa giai đoạn ung thƣ và đặc điểm mô bệnh học với sự methyl hóa gen SHOX2 đƣợc kiểm tra bằng kiểm định Fisher’s exact với giá trị
p < 0.05 đƣợc coi là có ý nghĩa thống kê.
Đồ thị ROC và các phân tích thống kê trong nghiên cứu đƣợc thực hiện bằng phần mềm GraphPad Prism 7.04 (GraphPad Software, Mỹ).
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết DNA 3.1. Tách chiết DNA
3.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu FFPE
Sáu đến tám lát cắt với độ dày 10 µm, kích thƣớc khoảng 0.5x1 cm của các mẫu FFPE đƣợc sử dụng để tách chiết DNA tổng số bằng kit QIAamp® DNA FFPE (Qiagen). DNA tổng số đƣợc điện di trên gel agarose 1 % để kiểm tra mức độ đứt gãy, đồng thời đƣợc xác định nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch thông qua các giá trị hấp thụ ánh sáng (OD) trên máy quang phổ NanoDrop 2000. Kết quả điện di đƣợc minh họa trên Hình 3.1.
Hình 3.1: Kết quả điện di DNA tổng số tách từ mẫu FFPE. K1→K10, C1→C10: DNA tổng số tách từ mẫu FFPE ung thƣ phổi và mẫu FFPE bệnh phổi lành tính. Giếng TC: Thang chuẩn DNA 4,6 kb (PTN Sinh Y).
Nồng độ DNA tổng số thu đƣợc khá cao và tƣơng đối khác nhau giữa các mẫu, trung bình là 153,49 ng/µl. Điều này là do: (1) lƣợng mơ có trong các lát cắt của mỗi mẫu là khác nhau, (2) sự đứt gãy DNA ở mỗi mẫu khơng giống nhau, các đoạn DNA kích thƣớc nhỏ (< 100 bp) dễ bị mất sau quá trình tách chiết khiến nồng độ giảm [64]. Có thể thấy rõ sự đứt gãy trên Hình 3.1, các mẫu DNA có vệt smear với độ đậm nhạt khác nhau trên bản gel, một số mẫu chỉ có vệt smear tƣơng ứng với kích thƣớc nhỏ (~ 1 kb) chứng tỏ lƣợng DNA thu đƣợc ít và đứt gãy nhiều. Việc đứt gãy DNA chủ yếu là do tác động của formaldehyde – thành phần chính của formalin tạo nên các liên kết giữa DNA – protein, DNA – DNA trong quá trình cố định mẫu.
Cụ thể là tạo liên kết giữa hai sợi DNA với nhau hoặc giữa nhóm amin (NH2) của lysine trong phân tử protein histon với các base adenine hoặc guanine trong phân tử DNA trong mẫu, dẫn tới làm giảm tính ổn định của sợi DNA [30]. Do nồng độ DNA tách từ mẫu FFPE không đảm bảo tƣơng quan với lƣợng DNA gen đích nên sự có mặt của đoạn gen đích SHOX2 trong DNA tổng số đƣợc đánh giá thông qua phản ứng PCR với cặp mồi SHOX2 (Bảng 2.4). Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 2 % (Hình 3.2).
Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện sự có mặt của gen đích SHOX2 trong
mẫu DNA tách từ bệnh phẩm FFPE. (--): Đối chứng âm (không chứa khuôn DNA); K1→K6, C1→C6: Sản phẩm PCR của DNA tổng số tách từ mẫu FFPE ung thƣ phổi và mẫu FFPE bệnh phổi lành tính; TC: Thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas).
Kết quả điện di trên Hình 3.2 cho thấy băng DNA có kích thƣớc 232 bp đƣợc khuếch đại từ gen đích SHOX2 trong DNA tổng số của các mẫu FFPE. Kết quả này khẳng định DNA tách từ các mẫu FFPE đủ chất lƣợng để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2. Tách chiết ccfDNA từ mẫu huyết tương
Do ccfDNA có hàm lƣợng thấp (ng/ml) và kích thƣớc ngắn (180 – 200 bp) nên quá trình tách chiết ccfDNA từ các mẫu huyết tƣơng gặp nhiều khó khăn [27,74]. Ngoài ra, ảnh hƣởng của việc liên kết với protein trong huyết tƣơng khiến ccfDNA sau tách chiết có độ tinh sạch thấp. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tơi quyết định lựa chọn kit QIAamp Circulating Nucleic Acid (Qiagen), một trong các kit cho lƣợng thu hồi ccfDNA cao nhất và đƣợc khuyến cáo sử dụng trong nhiều nghiên
cứu, để tách chiết ccfDNA từ mẫu huyết tƣơng bệnh nhân ung thƣ phổi và ngƣời bình thƣờng [41]. Tuy nhiên, giống nhƣ các kit tách ccfDNA sử dụng cột silica, nhƣợc điểm của chúng là dễ làm mất các đoạn DNA kích thƣớc ngắn (< 100 bp) khiến hiệu suất thu hồi thƣờng < 20 %. [19]. Vì nguyên nhân này nên các kit tách ccfDNA hiện nay thƣờng yêu cầu bổ sung thêm chất mang (bản chất là các nucleotide) trong quy trình tách chiết nhằm mục đích tăng hiệu suất thu hồi các đoạn DNA kích thƣớc nhỏ. Do đó, việc xác định nồng độ bằng máy quang phổ cho các mẫu ccfDNA tách bằng kit sẽ khơng chính xác do có chứa các chất mang. Ngoài ra, do nồng độ ccfDNA trong huyết tƣơng khá thấp nên cũng không đủ mẫu để kiểm tra chất lƣợng trên gel điện di. Vì vậy, các mẫu ccfDNA tách từ kit sẽ đƣợc xử lý bisulfite và sử dụng trực tiếp cho phản ứng realtime PCR, kiểm tra chất lƣợng thơng qua sự khuếch đại gen tham chiếu (Hình 3.3). Trong nghiên cứu này, chúng tơi lựa chọn gen tham chiếu là một đoạn nằm trên gen SHOX2 khuếch đại bởi cặp
mồi Un-SHOX2-F/R. Vì cặp mồi Un-SHOX2-F/R đƣợc thiết kế ở vị trí khơng có CG trong trình tự DNA sau xử lý nên lƣợng sản phẩm tạo ra sẽ đại diện cho toàn bộ lƣợng DNA đƣợc xử lý trong mẫu [15].
Hình 3.3: Tín hiệu khuếch đại đoạn gen tham chiếu SHOX2 có mặt trong 9 mẫu ccfDNA
đã xử lý bisulfite. ΔRn là cƣờng độ tín hiệu đƣợc tạo ra qua mỗi chu kỳ. Các đƣờng cong với màu sắc khác nhau thể hiện cƣờng độ tín hiệu của các mẫu khác nhau.
ccfDNA đƣợc xem là tập hợp của các đoạn DNA ngắn có kích thƣớc khoảng 180 – 200 bp [27,74]. Sự có mặt của DNA có kích thƣớc lớn hơn có thể do nhiễm
DNA tổng số tạo ra từ bạch cầu bị vỡ khi thu nhận huyết tƣơng, do đó lƣợng ccfDNA đánh giá qua phản ứng realtime PCR sẽ bị cao hơn so với lƣợng thực tế trong mẫu. Vì vậy, chúng tơi kiểm tra sự có mặt của các đoạn DNA > 200 bp trong ccfDNA tƣơng ứng với kích thƣớc của DNA tổng số từ bạch cầu [21,48]. Tám mẫu ccfDNA đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên để làm khuôn trong phản ứng PCR với hai cặp mồi 250 bp-F/R, 580 bp-F/R cho sản phẩm khuếch đại 250 bp và 580 bp. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 8 %. (Hình 3.4).
Hình 3.4: Kết quả PCR khuếch đại các đoạn DNA 250 bp (A) và đoạn 580 bp (B) từ ccfDNA sau tách chiết. (--): Đối chứng âm (khơng có DNA khn); (+): Đối chứng dƣơng mẫu DNA tổng số tách từ bạch cầu; TC: Thang chuẩn DNA Kb plus (Invitrogen).
Kết quả ảnh điện di cho thấy tám mẫu ccfDNA tách bằng kit QIAamp Circulating Nucleic Acid (Qiagen) đều có băng 250 bp và 580 bp. Các băng DNA khuếch đại rất đậm. Nhƣ vậy, mặc dù tuân thủ các yêu cầu của việc thu nhận huyết tƣơng (mục 2.4.2), có thể thấy ccfDNA sau khi tách khả năng cao có lẫn DNA tổng số từ bạch cầu. Lý do chính có thể là do q trình bảo quản và thu huyết tƣơng đã khiến bạch cầu bị vỡ và giải phóng DNA tổng số lẫn vào huyết tƣơng. Để giảm thiểu tối đa nguy cơ này, nhiều nhà nghiên cứu đã khuyến cáo một số giải pháp nhƣ: (1) sử dụng ống thu máu CELL-FREE DNA BCT® (Streck, Mỹ) để thu mẫu vì đây
là loại ống đặc biệt chứa hóa chất bảo quản giúp ổn định các tế bào bạch cầu, ngăn giải phóng DNA tổng số vào huyết tƣơng; (2) thay đổi quy trình thu huyết tƣơng từ hai lần sang ly tâm một lần tốc độ thấp (1000 – 3000 g) trong thời gian dài (10 – 15 phút) hoặc ly tâm nhiều lần ở tốc độ thấp để tránh ly giải tế bào bạch cầu [55,88]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tuân thủ hƣớng dẫn sử dụng của kit Qiagen (ly tâm hai lần, lần thứ hai tốc độ cao hơn lần thứ nhất). Trong thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi sẽ quan tâm đến phân tích, so sánh kết quả của quy trình ly tâm một lần và hai lần.
3.2. Xử lý bisulfite
DNA tổng số từ mẫu FFPE và ccfDNA từ mẫu huyết tƣơng đƣợc xử lý bisulfite với hai quy trình khác nhau tƣơng ứng cho từng loại mẫu (Phụ lục 8). DNA sau xử lý đƣợc giữ trong 20 µl đệm của kit. Sau xử lý, DNA từ các mẫu FFPE đƣợc kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng phƣơng pháp đo quang phổ hấp thụ. Kết quả đo cho thấy nồng độ của các mẫu DNA sau xử lý chủ yếu trong khoảng từ 3 – 15 ng/µl, chỉ có một số mẫu có nồng thấp dƣới 3 ng/µl và cao trên 15 ng/µl. Với nồng độ mẫu thấp và lƣợng mẫu thu đƣợc ít nhƣ vậy, chúng tơi lựa chọn 1 µl khn tƣơng ứng với nồng độ 3 – 15 ng/µl. Với những mẫu có nồng độ thấp (< 3 ng/µl) chúng tơi tăng lƣợng khn, tối đa là 3 µl để đạt nồng độ tối thiểu là 3 ng/µl.
Các mẫu ccfDNA do có lẫn chất mang (carrier RNA) đƣợc thêm vào trong quy trình xử lý nên không đƣợc kiểm tra nồng độ mà sử dụng trực tiếp 2 µl vào phản ứng realtime PCR. Giá trị Ct của gen tham chiếu đƣợc xem xét để điều chỉnh lƣợng mẫu cho tối ƣu.
3.3. Tạo mẫu chuẩn cho phƣơng pháp định lƣợng PCR
Trong nghiên cứu này, tỷ lệ methyl hóa SHOX2 ở các mẫu bệnh phẩm và mẫu đối chứng đƣợc định lƣợng tƣơng đối theo phƣơng pháp ΔΔCt của Livak thông qua các mẫu chuẩn có tỷ lệ methyl hóa đã biết [46]. Mẫu chuẩn sẽ đƣợc tạo ra bằng cách phối trộn plasmid Me-Shox chứa trình tự gen SHOX2 bị methyl hóa với plasmid Un-Shox chứa trình tự gen SHOX2 khơng bị methyl hóa và 10 ng DNA
tổng số tách từ mẫu máu ngƣời bình thƣờng (Bảng 2.7). Hai plasmid Me-Shox và plasmid Un-Shox đƣợc chuyển thành dạng thẳng để làm tăng độ nhạy phát hiện