CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết DNA
3.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu FFPE
Sáu đến tám lát cắt với độ dày 10 µm, kích thƣớc khoảng 0.5x1 cm của các mẫu FFPE đƣợc sử dụng để tách chiết DNA tổng số bằng kit QIAamp® DNA FFPE (Qiagen). DNA tổng số đƣợc điện di trên gel agarose 1 % để kiểm tra mức độ đứt gãy, đồng thời đƣợc xác định nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch thông qua các giá trị hấp thụ ánh sáng (OD) trên máy quang phổ NanoDrop 2000. Kết quả điện di đƣợc minh họa trên Hình 3.1.
Hình 3.1: Kết quả điện di DNA tổng số tách từ mẫu FFPE. K1→K10, C1→C10: DNA tổng số tách từ mẫu FFPE ung thƣ phổi và mẫu FFPE bệnh phổi lành tính. Giếng TC: Thang chuẩn DNA 4,6 kb (PTN Sinh Y).
Nồng độ DNA tổng số thu đƣợc khá cao và tƣơng đối khác nhau giữa các mẫu, trung bình là 153,49 ng/µl. Điều này là do: (1) lƣợng mơ có trong các lát cắt của mỗi mẫu là khác nhau, (2) sự đứt gãy DNA ở mỗi mẫu không giống nhau, các đoạn DNA kích thƣớc nhỏ (< 100 bp) dễ bị mất sau quá trình tách chiết khiến nồng độ giảm [64]. Có thể thấy rõ sự đứt gãy trên Hình 3.1, các mẫu DNA có vệt smear với độ đậm nhạt khác nhau trên bản gel, một số mẫu chỉ có vệt smear tƣơng ứng với kích thƣớc nhỏ (~ 1 kb) chứng tỏ lƣợng DNA thu đƣợc ít và đứt gãy nhiều. Việc đứt gãy DNA chủ yếu là do tác động của formaldehyde – thành phần chính của formalin tạo nên các liên kết giữa DNA – protein, DNA – DNA trong quá trình cố định mẫu.
Cụ thể là tạo liên kết giữa hai sợi DNA với nhau hoặc giữa nhóm amin (NH2) của lysine trong phân tử protein histon với các base adenine hoặc guanine trong phân tử DNA trong mẫu, dẫn tới làm giảm tính ổn định của sợi DNA [30]. Do nồng độ DNA tách từ mẫu FFPE không đảm bảo tƣơng quan với lƣợng DNA gen đích nên sự có mặt của đoạn gen đích SHOX2 trong DNA tổng số đƣợc đánh giá thông qua phản ứng PCR với cặp mồi SHOX2 (Bảng 2.4). Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 2 % (Hình 3.2).
Hình 3.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR phát hiện sự có mặt của gen đích SHOX2 trong
mẫu DNA tách từ bệnh phẩm FFPE. (--): Đối chứng âm (không chứa khuôn DNA); K1→K6, C1→C6: Sản phẩm PCR của DNA tổng số tách từ mẫu FFPE ung thƣ phổi và mẫu FFPE bệnh phổi lành tính; TC: Thang chuẩn DNA 100 bp (Fermentas).
Kết quả điện di trên Hình 3.2 cho thấy băng DNA có kích thƣớc 232 bp đƣợc khuếch đại từ gen đích SHOX2 trong DNA tổng số của các mẫu FFPE. Kết quả này khẳng định DNA tách từ các mẫu FFPE đủ chất lƣợng để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.