CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.4. Phân tích mức độ methyl hóa gen SHOX2 trong mẫu FFPE và mẫu
huyết tƣơng
Trƣớc tiên, chúng tôi xây dựng đƣờng chuẩn biểu diễn giá trị Ct ở các nồng độ khuôn khác nhau trong phản ứng khuếch đại gen tham chiếu (đƣờng chuẩn Un- SHOX2) và gen đích (đƣờng chuẩn Me-SHOX2) và thu đƣợc hiệu suất phản ứng nằm trong khoảng 90 – 110 % (Hình 3.8). Cụ thể hiệu suất phản ứng tính theo đƣờng chuẩn Un-SHOX2 và Me-SHOX2 xấp xỉ bằng nhau, lần lƣợt là 94,06 % và 97,67 %, phù hợp với kết quả đã đƣợc chứng minh bằng đồ thị ở Hình 3.7. Hệ số tuyến tính R2 của đƣờng chuẩn > 0.999 cho phép chúng tơi tin tƣởng vào mẫu chuẩn và điều kiện thí nghiệm. Đặc biệt, đƣờng chuẩn Me-SHOX2 đƣợc xây dựng từ các mẫu chuẩn có tỷ lệ trộn Me-Shox : Un-Shox khác nhau (1:1, 1:2, 1:10, 1:20, 1:200) nhƣng có hệ số R2 cao và thu đƣợc hiệu suất tốt (97,67 %). Do đó, có thể thấy khả năng khuếch đại của phản ứng chỉ phụ thuộc vào lƣợng khuôn đầu vào mà không bị ảnh hƣởng bởi sự ƣu tiên khuếch đại những mẫu có tỷ lệ methyl hóa cao hoặc thấp.
Hình 3.8: Đƣờng chuẩn biểu diễn giá trị Ct ở các nồng độ khuôn khác nhau trong phản
ứng khuếch đại gen tham chiếu (A) và gen đích (B).
Dựa vào đƣờng chuẩn cho gen tham chiếu (Hình 3.8 – A), các mẫu có Ct lớn hơn 33 đƣợc coi là khơng đủ lƣợng khn để xác định methyl hóa. Vì vậy, trong trƣờng hợp này, các mẫu sẽ đƣợc tăng lƣợng khn để lặp lại thí nghiệm hoặc bị loại khỏi nghiên cứu.
Từ đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng cho gen đích SHOX2 (Hình 3.8 – B), có thể
thấy độ nhạy phát hiện methyl là 0.1 %, tƣơng đƣơng 34,5 chu kỳ. Các mẫu có Ct lớn hơn 35 đƣợc coi là khơng bị methyl hóa.
Với các điều kiện trên, chúng tơi tiến hành định lƣợng mức độ methyl hóa gen
SHOX2 trong 127 mẫu FFPE và 42 mẫu huyết tƣơng. DNA sau xử lý sẽ đƣợc sử
dụng cho phản ứng realtime PCR với hai cặp mồi Un-SHOX2 và Me-SHOX2 và cùng với các mẫu chuẩn để xác định tỷ lệ methyl hóa. Kết quả tỷ lệ methyl hóa
SHOX2 tính theo phƣơng pháp ΔΔCt của các mẫu đƣợc minh họa trong Bảng 3.1 và
Bảng 3.1: Giá trị Ct và phần trăm methyl hoá SHOX2 của một số mẫu
Loại mẫu Mẫu Ct ΔΔCt (100 %
methyl hóa) Methyl hóa (%) Un-SHOX2 Me-SHOX2 Mẫu DNA tổng số ung thƣ phổi K1 28,57 Undetermined 12,00 0,02 K2 31,28 32,30 0,83 56,42 K3 27,17 29,59 2,45 18,32 K4 29,35 33,69 4,27 5,19 K5 34,18 Undetermined Mẫu DNA tổng số bệnh phổi lành tính C1 33,04 Undetermined C2 28,18 36,00 7,52 0,54 C3 28,92 38,06 9,07 0,19 C4 32,76 34,90 1,99 25,26 C5 30,36 Undetermined 12,00 0,03 Mẫu ccfDNA ung thƣ phổi cf-K1 30,50 31,39 0,96 51,27 cf-K2 25,97 31,66 6,03 1,53 cf-K3 25,82 32,72 7,24 0,66 cf-K4 31,65 32,91 1,82 28,29 cf-K5 28,66 34,04 5,45 2,28 Mẫu ccfDNA bình thƣờng cf-C1 30,25 Undetermined 12,00 0,02 cf-C2 26,97 37,94 11,24 0,04 cf-C3 25,17 37,7 12,80 0,01 cf-C4 27,81 34,18 12,29 0,02 cf-C5 29,37 31,57 2,03 24,57
Chúng tôi phát hiện thấy một số mẫu có giá trị CtUn-SHOX2 lớn hơn 33 nhƣ mẫu K5 (Ct = 34,18), mẫu C1 (Ct = 33,04). Nồng độ của hai mẫu này trong phản ứng qPCR khoảng 10 ng, tƣơng ứng với 1 µl DNA sau xử lý. Bên cạnh đó, có những mẫu nồng độ đƣa vào phản ứng chỉ khoảng 4 – 5 ng nhƣng có CtUn-SHOX2 thấp hơn nhƣ mẫu K1, K2 và C4, tƣơng ứng là 28,57, 31,28 và 32,76. Lý do có thể là chất lƣợng các mẫu không đồng đều nhƣ nhau, DNA mẫu FFPE qua quá trình xử lý thƣờng bị đứt gãy, phân mảnh. Những mẫu bị đứt gãy nhiều có hiệu quả khuếch đại
kém hơn so với các mẫu khơng đứt gãy hoặc đứt gãy ít. Thêm vào đó, chúng tơi nhận thấy CtMe-SHOX2 của hai mẫu K5 và C1 đều khơng lên tín hiệu (Undetermined). Do lƣợng khn sử dụng là 10 ng nên chúng tôi quyết định tăng lên 20 – 30 ng, tƣơng ứng 2 – 3 ul và lặp lại phản ứng qPCR để thu đƣợc Ct nhỏ hơn 33 thỏa mãn yêu cầu. Kết quả cho thấy, mẫu K5 tăng lƣợng khuôn từ 12 ng lên 36 ng cho Ct giảm từ 34,18 xuống 32,92; mẫu C1 sau khi tăng lƣợng khuôn từ 9,5 ng lên 28,5 ng cho Ct giảm từ 33,04 xuống 31,12. Bên cạnh đó, có hai mẫu nồng độ sau xử lý rất thấp, khi tăng lƣợng khn đến 3 µl thì CtUn-SHOX2 vẫn khá lớn (tƣơng ứng là 33,81 và 35,72), do đó chúng tơi quyết định loại bỏ hai mẫu này khỏi nghiên cứu do chất lƣợng mẫu không đạt tiêu chuẩn.
Dựa vào tỷ lệ methyl hóa SHOX2 tính tốn đƣợc, chúng tôi xây dựng đồ thị biểu diễn sự phân bố tỷ lệ methyl hố giữa nhóm ung thƣ phổi và nhóm đối chứng của mẫu FFPE và mẫu huyết tƣơng (Hình 3.9). Sử dụng kiểm định phi tham số Mann-Whitney cho mẫu không phân phối chuẩn cho thấy tỷ lệ methyl hóa SHOX2 trong nhóm ung thƣ phổi cao hơn nhóm đối chứng (p<0.0001; 95% CI = 1,14 – 9,7 với mẫu mô FFPE, 95% CI = 1,51 – 16,15 với mẫu huyết tƣơng). Kết quả này tƣơng đồng với nghiên cứu của Kneip và cs. (2011) khi thực hiện trên 20 mẫu huyết tƣơng bệnh phổi lành tính và 20 mẫu huyết tƣơng ung thƣ phổi giai đoạn IV, cho thấy tỷ lệ methyl hóa của gen SHOX2 ở nhóm ung thƣ cao hơn nhóm đối chứng có ý nghĩa thống kê [40]. Nhƣ vậy, methyl hóa SHOX2 có khả năng trở thành dấu
Hình 3.9: Đồ thị phân bố tỷ lệ methyl hoá SHOX2 (%) giữa nhóm đối chứng và nhóm ung
thƣ phổi. (A) Mẫu FFPE; (B) Mẫu huyết tƣơng. **** p < 0.0001
Để đánh giá hiệu quả chẩn đoán của dấu chuẩn này, đồ thị đƣờng cong ROC đƣợc xây dựng cho hai loại mẫu cùng với các thơng số diện tích dƣới đƣờng cong (AUC) và giá trị 95 % CI (Hình 3.10).
Hình 3.10: Đồ thị đƣờng cong ROC. (A) Mẫu FFPE; (B) Mẫu huyết tƣơng.
Vì số lƣợng các mẫu huyết tƣơng không nhiều nhƣ mẫu FFPE nên chúng tôi không so sánh giá trị AUC của hai loại mẫu mà chỉ thực hiện phân tích trên từng loại mẫu. Có thể thấy trên Hình 3.10, giá trị AUC của mẫu FFPE và mẫu huyết tƣơng lần lƣợt là 0,76 và 0,90, chứng tỏ tiềm năng chẩn đoán của dấu chuẩn methyl hóa SHOX2 cho cả hai loại mẫu này trong bệnh ung thƣ phổi. Kết quả này cũng
tƣơng đồng với một vài nghiên cứu nhƣ của Kneip và cs. (2011) làm trên mẫu huyết
tƣơng cho AUC = 0,91, Ilse và cs. (2014) làm trên mẫu dịch rửa phế quản cho AUC = 0,92 [36,40].
Nhiều nghiên cứu bệnh – chứng (case – control) về sự methyl hóa SHOX2 đã
chỉ ra SHOX2 bị methyl hóa ở mức độ thấp trong các bệnh nhân mắc bệnh phổi lành tính hoặc ngƣời bình thƣờng [17,35,40,62]. Điều này đòi hỏi một giá trị cut-off methyl để có thể phân chia kết quả dƣơng tính hay âm tính với bệnh ung thƣ phổi. Mỗi giá trị cut-off khác nhau sẽ tƣơng ứng với độ nhạy và độ đặc hiệu khác nhau. Giá trị cut-off ∆∆Ct thấp hơn sẽ cho độ đặc hiệu cao hơn nhƣng độ nhạy thấp hơn và ngƣợc lại [68]. Dựa vào đồ thị với mẫu FFPE (Hình 3.11 – A) nhận thấy khi chọn giá trị cut-off ∆∆Ct = 5,99 (tƣơng ứng 1,57 % methyl hóa) sẽ cho độ nhạy 62,67 %, độ đặc hiệu 88 %. Với mẫu ccfDNA (Hình 3.11 – B), khi chọn giá trị cut- off ∆∆Ct = 7,62 (tƣơng ứng 0,51 % methyl hóa) sẽ cho độ nhạy 90 % và độ đặc hiệu 90,91 %. Tuy nhiên, nếu chọn giá trị cut-off ∆∆Ct thấp hơn (tƣơng ứng giá trị cut-off methyl cao hơn) sẽ tăng độ đặc hiệu và giảm độ nhạy. Nhƣ vậy, tuỳ thuộc vào mục đích nghiên cứu mà giá trị cut-off sẽ đƣợc thay đổi cho phù hợp.
Hình 3.11: Đồ thị phân bố methyl hóa SHOX2 theo ∆∆Ct giữa nhóm đối chứng và nhóm
ung thƣ phổi với các giá trị cut-off khác nhau. (A) Mẫu FFPE; (B) Mẫu huyết tƣơng.
Có nhiều phƣơng pháp chọn giá trị cut-off khác nhau. Hiện nay, trong nhiều nghiên cứu giá trị cut-off đƣợc chọn để tỷ lệ dƣơng tính giả nhỏ hơn hoặc bằng 5% cho nhóm đối chứng, nghĩa là độ đặc hiệu lớn hơn 95 % [17]. Áp dụng nguyên tắc này, chúng tôi chọn các giá trị cut-off ∆∆Ct cho mẫu FFPE và mẫu huyết tƣơng lần
lƣợt là 4,33 (4,98 % methyl hóa) và 2,77 (14,62 % methyl hóa). Với giá trị cut-off lựa chọn, độ đặc hiệu của hai loại mẫu đều lớn hơn 95 % chứng tỏ tỷ lệ dƣơng tính giả thấp, khả năng chẩn đốn sai ít. Tuy nhiên, độ nhạy của cả hai loại mẫu đều thấp (< 60 %). Kết quả của chúng tơi có sự tƣơng đồng với một số nghiên cứu khác. Nghiên cứu của Ilse và cs. (2013) trên các mẫu dịch tràn màng phổi cho độ nhạy 39,5 % và độ đặc hiệu là 96,2 % [35]. Một nghiên cứu khác cũng sử dụng loại mẫu này cho độ nhạy rất thấp và độ đặc hiệu cao, tƣơng ứng 12,1 % và 100 % [16]. Khi nghiên cứu trên loại mẫu huyết tƣơng, Kneip và cs. (2011) thu đƣợc độ nhạy và độ đặc hiệu tƣơng ứng 59,6 % và 89,7 %, nhƣng lựa chọn tỷ lệ dƣơng tính giả lớn hơn 5 % [40]. Do đó, nếu lựa chọn cut-off để tăng độ đặc hiệu đến 95 %, giảm độ nhạy và tỷ lệ dƣơng tính giả thì kết quả tƣơng tự nhƣ nghiên cứu của chúng tôi. Hiệu quả chẩn đoán trên hai loại mẫu và các thông số về độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đốn dƣơng tính (PPV), giá trị tiên đốn âm tính (NPV) tính theo giá trị cut-off lựa chọn của nghiên cứu đƣợc trình bày trong Bảng 3.2 và Hình 3.12.
Bảng 3.2: Các thơng số về hiệu quả chẩn đốn của mẫu FFPE và mẫu huyết tƣơng
Loại mẫu AUC Độ nhạy
(%) Độ đặc hiệu (%) PPV (%) NPV (%) Giá trị 95 % CI Mẫu FFPE 0,76 0,67 – 0,84 50,67 96,00 95,00 56,47
Mẫu huyết tƣơng 0,90 0,8 – 1,0 40,00 95,45 88,89 63,64
Hình 3.12: Kết quả độ nhạy và độ đặc hiệu của phân tích methyl hóa SHOX2 tại giá trị
Trong nghiên cứu của chúng tôi, độ nhạy của mẫu huyết tƣơng khá thấp và thấp hơn độ nhạy của mẫu FFPE, tƣơng ứng là 40 % và 50,67 %. Giải thích cho vấn đề này đã đƣợc đƣa ra trong một số báo cáo. Điển hình là phân tích dữ liệu đa trung tâm (Meta analysis) của Zhao và cs. (2015) thực hiện cho tám nghiên cứu ở năm loại mẫu khác nhau: mẫu mô, mẫu hạch lympho, mẫu dịch tràn màng phổi, mẫu dịch rửa phế quản và mẫu huyết tƣơng. Trong đó, mẫu mơ có độ nhạy tƣơng đƣơng mẫu hạch lympho (trên 94 %) và cao hơn mẫu dịch rửa phế quản (64 % – 78 %), còn mẫu huyết tƣơng và mẫu dịch tràn màng phổi có độ nhạy thấp nhất (tƣơng ứng 60 % và 50 %). Lý do của sự khác biệt này là do lƣợng DNA bị methyl hóa có mặt trong các loại mẫu khác nhau là khác nhau. Các mẫu có lƣợng DNA cao sẽ có khả năng phát hiện DNA bị methyl hóa cao hơn. Do đó, mẫu huyết tƣơng có hàm lƣợng DNA thấp dẫn đến lƣợng DNA methyl hóa ít nên nằm dƣới ngƣỡng phát hiện [82]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, mẫu FFPE cũng cho độ nhạy khơng cao có thể do bản chất DNA trong mẫu FFPE khác với mẫu mô tƣơi. Nhƣ đã đề cập, DNA của mẫu FFPE thƣờng bị đứt gãy, khơng tồn vẹn, đồng thời lƣợng formaldehyde cịn sót lại sau khi tách cũng có thể ảnh hƣởng tới phản ứng PCR định lƣợng khiến độ nhạy của loại mẫu này khá thấp [30].
Trong xét nghiệm lâm sàng, giá trị tiên đốn dƣơng tính (PPV) và giá trị tiên đốn âm tính (NPV) có ý nghĩa quan trọng cho phép xác định mức độ tin cậy của một kết quả xét nghiệm. Giá trị PPV đƣợc tính là khả năng mắc bệnh khi có kết quả xét nghiệm dƣơng tính, giá trị NPV là khả năng khơng mắc bệnh khi có kết quả xét nghiệm âm tính. Các giá trị này phụ thuộc vào độ nhạy, độ đặc hiệu và mức độ hiện hành của loại ung thƣ đó [56]. Trong kết quả của chúng tôi, hai loại mẫu FFPE và mẫu huyết tƣơng đều có giá trị PPV cao, lần lƣợt là 95 % và 88,89 %, giá trị NPV còn thấp, lần lƣợt là 56,47 % và 63,64 %. Kết quả này tƣơng đồng với nghiên cứu của Dietric và cs. (2012) khi phân tích methyl hóa SHOX2 trên mẫu dịch tràn màng phổi cho giá trị PPV là 100 % và giá trị NPV là 52,3 % hay nghiên cứu của Ilse và cs. (2014) trên mẫu dịch rửa phế quản cho giá trị PPV là 98 % và NPV là 60,9 % [17,36]. Nhƣ vậy, có thể thấy phân tích methyl hóa SHOX2 có tiềm năng trong việc
xác định những bệnh nhân mắc ung thƣ phổi do có giá trị PPV cao, nhƣng cịn bỏ sót những ngƣời bị ung thƣ phổi do giá trị NPV thấp. Do đó, để tăng mức độ chẩn đốn chính xác nên kết hợp các dấu chuẩn với nhau [36,60,68]. Dấu chuẩn đƣợc lựa chọn để kết hợp sao cho không làm giảm độ đặc hiệu chung của phân tích. Nhiều nghiên cứu hiện nay đã kết hợp dấu chuẩn methyl hóa SHOX2 với các dấu chuẩn khác để tạo ra các panel dấu chuẩn có hiệu quả chẩn đốn ung thƣ phổi cải thiện rõ rệt. Ví dụ nhƣ kết hợp dấu chuẩn methyl hóa SHOX2 với các kết quả bệnh lý học
đối với mẫu hạch lympho ở bệnh nhân ung thƣ phổi, Darwiche và cs. (2013) cho thấy độ nhạy tăng từ 94 % lên 99 %, độ đặc hiệu khơng đổi 99 %, đạt hiệu quả chẩn đốn tối ƣu, có tiềm năng trở thành tiêu chuẩn vàng cho chẩn đoán ung thƣ phổi [11]. Tƣơng tự, nghiên cứu của Ilse và cs. (2013) kết hợp tỷ lệ methyl hóa SHOX2 với kết quả xét nghiệm tế bào học cho độ nhạy tăng từ 64 % lên 69 % và độ đặc hiệu không đổi 98 % cũng cho thấy tiềm năng của panel dấu chuẩn này [35]. Gần đây một panel dấu chuẩn đang đƣợc nhiều nhà nghiên cứu quan tâm đó là sự kết hợp giữa các vùng methyl hóa ở các gen khác nhau để đạt đƣợc độ nhạy tối ƣu. Ví dụ nhƣ nghiên cứu của Zhang và cs. (2017), khi kết hợp SHOX2 và RASSF1A cho
độ nhạy là 81 %, độ đặc hiệu là 97,4 % [81]. Ilse và cs. (2014) kết hợp dấu chuẩn methyl hóa của bốn gen SHOX2, RASSF1A, APC và p16INK4A cho độ nhạy 71 % và độ đặc hiệu 95 % [36]. Đặc biệt, sự kết hợp giữa vùng methyl hóa gen SHOX2 và
vùng methyl hóa gen PTGER4 đƣợc áp dụng trong bộ kit thƣơng mại Epi proLung cho chẩn đoán ung thƣ phổi sử dụng mẫu huyết tƣơng đã cho thấy hiệu quả chẩn đoán của các panel dấu chuẩn này (AUC = 0,83; độ nhạy 60 %, độ đặc hiệu 95 %) [85].
Đánh giá mối tƣơng quan giữa tình trạng methyl hóa SHOX2 của mẫu FFPE và mẫu huyết tƣơng với các đặc điểm lâm sàng của bệnh nhân ung thƣ phổi, chúng tơi nhận thấy khơng có mối liên quan có ý nghĩa giữa mức độ methyl hóa SHOX2 với độ tuổi, đặc điểm mô bệnh học, giai đoạn ung thƣ, đột biến EGFR và các dấu chuẩn ung thƣ ở cả hai loại mẫu (Bảng 3.3, Phụ lục 12). Kết quả này tƣơng đồng với các nghiên cứu trƣớc đó [17,40]. Tuy nhiên, chúng tơi nhận thấy có mối liên hệ có ý
nghĩa (p<0,05) giữa mức độ methyl hóa SHOX2 với giới tính (nam) trong mẫu
FFPE (Bảng 3.3). Mặc dù chúng tơi khơng có số liệu về bệnh nhân hút thuốc nhƣng sự khác biệt có thể do nam giới thƣờng xuyên phải tiếp xúc với yếu tố nguy cơ là thuốc lá nhiều hơn so với nữ giới [3]. Hút thuốc đã đƣợc chứng minh là có ảnh hƣởng nghiêm trọng tới trạng thái methyl hóa của các gen nhƣ SHOX2, RASSF1A,…[36,45], do đó có thể giải thích đƣợc mối liên hệ giữa methyl hóa SHOX2 và giới tính.
Bảng 3.3: Mối liên quan giữa tình trạng methyl hóa SHOX2 với các đặc điểm lâm sàng của
bệnh nhân ung thƣ phổi trên mẫu FFPE. Me +/Me -: methyl hóa dƣơng tính/ âm tính, đƣợc quyết định với giá trị cutoff là 4,98 % methyl. Giá trị p có ý nghĩa (< 0.05) đƣợc in đậm.
Đặc điểm lâm sàng
SHOX2
Me + Me - Giá trị p (Fisher’s exact test)
Tuổi ≤50 (n=11) 5 6 0,7543 >50 (n=64) 33 31 Giới tính Nam (n=43) 28 15 0,0051 Nữ (n=32) 10 22 Phân nhóm mơ bệnh học UTPKTBN (n=66) 33 33 > 0,9999 Khác (n=9) 5 4
Giai đoạn (UICC) III (n=28) 12 16 0,2964 IV (n=47) 26 21 EGFR Dƣơng tính (n=32) 10 22 0,1422 Âm tính (n=10) 6 4 CEA ≤ 5 ng/ml (n=16) 10 13 0,4314 > 5 ng/ml (n=14) 22 17 CYFRA 21-1 ≤ 3.3 ng/ml (n=12) 12 13 0,6219 > 3.3 ng/ml (n=18) 23 19