CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.3. Tạo mẫu chuẩn cho phƣơng pháp định lƣợng PCR
Trong nghiên cứu này, tỷ lệ methyl hóa SHOX2 ở các mẫu bệnh phẩm và mẫu đối chứng đƣợc định lƣợng tƣơng đối theo phƣơng pháp ΔΔCt của Livak thông qua các mẫu chuẩn có tỷ lệ methyl hóa đã biết [46]. Mẫu chuẩn sẽ đƣợc tạo ra bằng cách phối trộn plasmid Me-Shox chứa trình tự gen SHOX2 bị methyl hóa với plasmid Un-Shox chứa trình tự gen SHOX2 khơng bị methyl hóa và 10 ng DNA
tổng số tách từ mẫu máu ngƣời bình thƣờng (Bảng 2.7). Hai plasmid Me-Shox và plasmid Un-Shox đƣợc chuyển thành dạng thẳng để làm tăng độ nhạy phát hiện trong phản ứng PCR. Đầu tiên, chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn ScaI để cắt hoàn tồn plasmid dạng siêu xoắn/trịn thành dạng thẳng. Thành phần và điều kiện phản ứng đƣợc trình bày trong Bảng 2.5. Sản phẩm xử lý với ScaI đƣợc điện di trên gel agarose 1 % (Hình 3.5) cho thấy cả hai plasmid Un-Shox và Me-Shox đều ở dạng thẳng. Hai plasmid sau cắt có kích thƣớc khoảng 3 kb phù hợp với kích thƣớc tính tốn đƣợc.
Hình 3.5: Kết quả xử lý plasmid Un-Shox và Me-Shox với enzyme giới hạn ScaI. T, S:
plasmid trƣớc khi xử lý và sau xử lý với ScaI; TC: Thang chuẩn DNA 1 kb (NEB).
Sản phẩm của phản ứng cắt đƣợc tinh sạch bằng kit PureLink® Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo Kit (Invitrogen). Nồng độ plasmid sau khi tinh sạch thu đƣợc rất thấp (khoảng 3 – 5 ng/µl). Vì vậy, 10 µl sản phẩm tinh sạch đƣợc điện di trên gel agarose 1 % để kiểm tra chất lƣợng. Kết quả điện di cho thấy băng plasmid sáng rõ (Hình 3.6 – A).
Hình 3.6: Kết quả điện di plasmid dạng thẳng Un-Shox và Me-Shox đƣợc tinh sạch sau khi cắt với enzyme giới hạn ScaI (A) và sau khi thực hiện phản ứng PCR đảo (B). Un-
Shox: plasmid Un-Shox tinh sạch; Me-Shox: plasmid Me-Shox tinh sạch; TC: Thang chuẩn DNA 1 kb (NEB) (A); Thang chuẩn DNA 4,6 kb (PTN Sinh Y) (B).
Chúng tôi nhận thấy phƣơng pháp sử dụng enzyme giới hạn cho nồng độ plasmid dạng thẳng thấp, lƣợng mẫu ít, có thể gặp nguy cơ enzyme giới hạn cắt khơng hồn tồn do cấu hình của plasmid [67]. Với mong muốn thu nhận lƣợng lớn plasmid dạng thẳng, chúng tôi lựa chọn phƣơng pháp PCR đảo với cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu tại vị trí cắt của enzyme giới hạn ScaI. Sản phẩm PCR sau đó đƣợc tinh sạch bằng kit Invitrogen và đo nồng độ. Kết quả cho thấy nồng độ plasmid thu đƣợc cao (> 20 ng/µl), độ tinh sạch tốt (chỉ số tinh sạch A260/A280 trong khoảng 1,8 – 2,0). Kết quả điện di 2 µl sản phẩm tinh sạch trên gel agarose 1 % đƣợc trình bày trong Hình 3.6 – B.
Ảnh điện di cho thấy các băng plasmid dạng thẳng sau khi tinh sạch to đậm và rõ nét, đúng kích thƣớc nhƣ tính tốn. Hai plasmid Un-Shox và Me-Shox sau đó đƣợc pha loãng và phối trộn với 10 ng DNA tổng số trƣớc xử lý tách từ mẫu máu ngƣời bình thƣờng để tạo ra các mẫu chuẩn có tỷ lệ Me-Shox/Un-Shox xác định (Bảng 2.7).
Trong nghiên cứu của chúng tơi, tỷ lệ methyl hố gen SHOX2 của các mẫu
bệnh phẩm đƣợc định lƣợng tƣơng đối theo phƣơng pháp ΔΔCt của Livak [46]. Theo phƣơng pháp này, giá trị Ct của gen đích và gen tham chiếu ở các mẫu bệnh phẩm đƣợc so sánh với giá trị Ct của hai gen này ở mẫu chuẩn (mục 2.4.6). Trong nghiên cứu này, gen tham chiếu là một đoạn nằm trên gen SHOX2 bao toàn bộ vùng lõi bị methyl hóa và khơng bị methyl hóa, đƣợc khuếch đại bởi cặp mồi Un- SHOX2-F/R. Gen đích là vùng gen SHOX2 bị methyl hóa đƣợc khuếch đại bởi cặp mồi Me-SHOX2-F/R. Việc lựa chọn gen tham chiếu và gen đích là các vùng trên gen SHOX2 sẽ giúp kết quả định lƣợng tƣơng đối đƣợc chính xác hơn [63].
Phƣơng pháp ΔΔCt đòi hỏi hiệu suất khuếch đại của gen đích và gen tham chiếu phải xấp xỉ bằng nhau [46]. Để đáp ứng đƣợc yêu cầu này, cần xây dựng đồ thị có trục hồnh là nồng độ (hoặc log nồng độ) của mẫu và trục tung là sự chênh lệch giá trị Ct (ΔCt) giữa gen đích và gen tham chiếu ở các nồng độ. Khi giá trị tuyệt đối của độ dốc đồ thị càng gần 0 chứng tỏ hiệu suất khuếch đại của gen đích và gen tham chiếu xấp xỉ bằng nhau, từ đó có thể sử dụng cơng thức ΔΔCt [46]. Dựa trên nguyên tắc này, chúng tôi thực hiện phản ứng realtime PCR cho hai plasmid Un-Shox và Me-Shox ở các nồng độ: 10000, 5000, 1000, 500, 50 (copies) với hai cặp mồi Un-SHOX2-F/R và Me-SHOX2-F/R. Mỗi nồng độ đƣợc lặp lại ba lần. Từ đó, xác định giá trị ΔCt giữa gen đích và gen tham chiếu ở từng nồng độ. Với các số liệu đã có, chúng tơi dựng đồ thị theo phƣơng pháp của Livak và cs. (2001) (Hình 3.7). Giá trị tuyệt đối của độ dốc đồ thị là 0,038, nhƣ vậy hiệu quả khuếch đại của gen đích và gen tham chiếu xấp xỉ bằng nhau, đủ điều kiện áp dụng phƣơng pháp ΔΔCt cho định lƣợng tỷ lệ methyl hóa trên các mẫu bệnh phẩm.
Hình 3.7: Đồ thị đánh giá hiệu quả khuếch đại của gen đích và gen tham chiếu. ∆Ct là sự
chênh lệch Ct giữa gen đích và gen tham chiếu của các mẫu chuẩn.