CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tách chiết DNA
3.1.2. Tách chiết ccfDNA từ mẫu huyết tương
Do ccfDNA có hàm lƣợng thấp (ng/ml) và kích thƣớc ngắn (180 – 200 bp) nên quá trình tách chiết ccfDNA từ các mẫu huyết tƣơng gặp nhiều khó khăn [27,74]. Ngoài ra, ảnh hƣởng của việc liên kết với protein trong huyết tƣơng khiến ccfDNA sau tách chiết có độ tinh sạch thấp. Vì vậy, trong nghiên cứu này, chúng tơi quyết định lựa chọn kit QIAamp Circulating Nucleic Acid (Qiagen), một trong các kit cho lƣợng thu hồi ccfDNA cao nhất và đƣợc khuyến cáo sử dụng trong nhiều nghiên
cứu, để tách chiết ccfDNA từ mẫu huyết tƣơng bệnh nhân ung thƣ phổi và ngƣời bình thƣờng [41]. Tuy nhiên, giống nhƣ các kit tách ccfDNA sử dụng cột silica, nhƣợc điểm của chúng là dễ làm mất các đoạn DNA kích thƣớc ngắn (< 100 bp) khiến hiệu suất thu hồi thƣờng < 20 %. [19]. Vì nguyên nhân này nên các kit tách ccfDNA hiện nay thƣờng yêu cầu bổ sung thêm chất mang (bản chất là các nucleotide) trong quy trình tách chiết nhằm mục đích tăng hiệu suất thu hồi các đoạn DNA kích thƣớc nhỏ. Do đó, việc xác định nồng độ bằng máy quang phổ cho các mẫu ccfDNA tách bằng kit sẽ khơng chính xác do có chứa các chất mang. Ngoài ra, do nồng độ ccfDNA trong huyết tƣơng khá thấp nên cũng không đủ mẫu để kiểm tra chất lƣợng trên gel điện di. Vì vậy, các mẫu ccfDNA tách từ kit sẽ đƣợc xử lý bisulfite và sử dụng trực tiếp cho phản ứng realtime PCR, kiểm tra chất lƣợng thơng qua sự khuếch đại gen tham chiếu (Hình 3.3). Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn gen tham chiếu là một đoạn nằm trên gen SHOX2 khuếch đại bởi cặp
mồi Un-SHOX2-F/R. Vì cặp mồi Un-SHOX2-F/R đƣợc thiết kế ở vị trí khơng có CG trong trình tự DNA sau xử lý nên lƣợng sản phẩm tạo ra sẽ đại diện cho toàn bộ lƣợng DNA đƣợc xử lý trong mẫu [15].
Hình 3.3: Tín hiệu khuếch đại đoạn gen tham chiếu SHOX2 có mặt trong 9 mẫu ccfDNA
đã xử lý bisulfite. ΔRn là cƣờng độ tín hiệu đƣợc tạo ra qua mỗi chu kỳ. Các đƣờng cong với màu sắc khác nhau thể hiện cƣờng độ tín hiệu của các mẫu khác nhau.
ccfDNA đƣợc xem là tập hợp của các đoạn DNA ngắn có kích thƣớc khoảng 180 – 200 bp [27,74]. Sự có mặt của DNA có kích thƣớc lớn hơn có thể do nhiễm
DNA tổng số tạo ra từ bạch cầu bị vỡ khi thu nhận huyết tƣơng, do đó lƣợng ccfDNA đánh giá qua phản ứng realtime PCR sẽ bị cao hơn so với lƣợng thực tế trong mẫu. Vì vậy, chúng tơi kiểm tra sự có mặt của các đoạn DNA > 200 bp trong ccfDNA tƣơng ứng với kích thƣớc của DNA tổng số từ bạch cầu [21,48]. Tám mẫu ccfDNA đƣợc lựa chọn ngẫu nhiên để làm khuôn trong phản ứng PCR với hai cặp mồi 250 bp-F/R, 580 bp-F/R cho sản phẩm khuếch đại 250 bp và 580 bp. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 8 %. (Hình 3.4).
Hình 3.4: Kết quả PCR khuếch đại các đoạn DNA 250 bp (A) và đoạn 580 bp (B) từ ccfDNA sau tách chiết. (--): Đối chứng âm (khơng có DNA khn); (+): Đối chứng dƣơng mẫu DNA tổng số tách từ bạch cầu; TC: Thang chuẩn DNA Kb plus (Invitrogen).
Kết quả ảnh điện di cho thấy tám mẫu ccfDNA tách bằng kit QIAamp Circulating Nucleic Acid (Qiagen) đều có băng 250 bp và 580 bp. Các băng DNA khuếch đại rất đậm. Nhƣ vậy, mặc dù tuân thủ các yêu cầu của việc thu nhận huyết tƣơng (mục 2.4.2), có thể thấy ccfDNA sau khi tách khả năng cao có lẫn DNA tổng số từ bạch cầu. Lý do chính có thể là do q trình bảo quản và thu huyết tƣơng đã khiến bạch cầu bị vỡ và giải phóng DNA tổng số lẫn vào huyết tƣơng. Để giảm thiểu tối đa nguy cơ này, nhiều nhà nghiên cứu đã khuyến cáo một số giải pháp nhƣ: (1) sử dụng ống thu máu CELL-FREE DNA BCT® (Streck, Mỹ) để thu mẫu vì đây
là loại ống đặc biệt chứa hóa chất bảo quản giúp ổn định các tế bào bạch cầu, ngăn giải phóng DNA tổng số vào huyết tƣơng; (2) thay đổi quy trình thu huyết tƣơng từ hai lần sang ly tâm một lần tốc độ thấp (1000 – 3000 g) trong thời gian dài (10 – 15 phút) hoặc ly tâm nhiều lần ở tốc độ thấp để tránh ly giải tế bào bạch cầu [55,88]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tuân thủ hƣớng dẫn sử dụng của kit Qiagen (ly tâm hai lần, lần thứ hai tốc độ cao hơn lần thứ nhất). Trong thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi sẽ quan tâm đến phân tích, so sánh kết quả của quy trình ly tâm một lần và hai lần.