Phương pháp nghiên cứu

2.4.1. Phân lập

Các mẫu phân lập được thu thập từ các nguồn gốc khác nhau tại Việt Nam (phân trẻ em bú sữa mẹ, động vật, sữa lên men, nước thải,..). Mỗi mẫu được làm giàu trên môi trường MRS broth (LabM, UK) bổ sung thêm 0,05% L-cysteine (Sigma, St. Louis, Mo, USA)-(Ký hiệu MRSc) [13]. Các mẫu sau đó đã được đồng nhất và pha

loãng trong nước muối sinh lý (0,85 %). Mỗi mẫu phân lập được cấy trải ở các nồng độ pha lỗng khác nhau trên mơi trường MRSc agar và ủ ở 37oC trong 48 giờ trong hộp yếm khí (AnaeroPack Rectangular Jar, Mitsubishi Gas Chemical Company). Nhặt các khuẩn lạc tách rời có hình thái khác nhau cấy vào các đĩa môi trường MRSc agar và ủ ở 37oC trong 48 giờ trong hộp yếm khí. Các chủng được quan sát bằng kính hiển vi (1000 x) sau khi nhuộm Gram, những mẫu có dạng hình thái "Y" hoặc “V” bắt màu tím được chọn để phân tích tiếp bằng sinh học phân tử.

2.4.2. Phân loại bằng sinh học phân tử

Tách chiết DNA

DNA của các chủng vi khuẩn nghi ngờ bifidobacteria được tách chiết theo phương pháp của Gabor và cộng sự (2003) [25]với một số bước cải biến để phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm

- Chủng vi khuẩn nghi ngờ bifidobacteria được ni kỵ khí trong ống mơi trường MRSc dịch thể trong 24 – 48 giờ.

-Ly tâm 1,5ml dịch nuôi vi khuẩn lấy sinh khối tế bào. - Hoà sinh khối tế bào trong 100l TE.

- Thêm 0,4 mg lysozyme. Trộn đều, ủ 370C trong 1 giờ. Trộn đều 3 phút. - Thêm 100l SDS 10% (w/v), trộn đều 2-3 phút trộn thật kỹ, ủ 37oC/30 phút.

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn đều. Ly tâm 15.000v/p, 15phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.

- Thêm 8 l RNAse 3 mg/ml, trộn đều, ủ ở 37oC trong 30 phút - Thêm 12l proteinase K (5 mg/ml), trộn đều, ủ 15 phút ở 56oC

- Thêm một thể tích tương đương phenol: chloroform: isoamyl alcohol (PCI), trộn đều. Ly tâm 15.000v/p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.

- Thêm 1 thể tích tương chloroform: isoamyl alcohol, trộn đều, ly tâm 15.000v/p, 15 phút. Chuyển lớp dịch phía trên sang ống Eppendoft khác.

- Thêm 1/10 V Natri acetat 3M và 1ml Ethanol 100%, đảo trộn. Đặt trong đá 30 phút.

- Ly tâm 15.000v/p trong 15 phút. Bỏ lớp dịch trên. - Rửa tủa bằng ethanol 70%.

- Làm khô DNA bằng máy cô quay chân khơng. - Hồ tan DNA trong 50-100l nước hoặc TE. - Kiểm tra sản phẩm DNA bằng điện di

Đun tan agarose 1% (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agarose: 1g) để ấm, bổ sung Redsafe theo tỷ lệ 1µl/15 ml gel, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong 300ml dung dịch 1 X TAE. Trộn 1l dung dịch 6X loading buffer với 5l mẫu trộn đều, nhỏ vào giếng. Chạy điện di bằng dòng điện một chiều với điện thế 100V, cưòng độ dòng điện 80 mA trong 30 phút, Quan sát trên máy soi gel.

Xác định sự có mặt của gen F-6-PPK

Gen xfpmã hóa cho F-6-PPK là enzyme đặc trưng cho chiBifidobacterium.

Thành phần phản ứng

Thành phần Thể tích (l)

10X buffer 10

dNTP 2.0 mM 10

Mồi xuôi (10 pmol/l) 2

Mồi ngược (10 pmol/l) 2

Taq polymerase (5u/l) 2

ADN khuôn (50-100g/l) 1-2

H2O đủ 100

Mồi :

Mồi xuôi U1R: 5’- ACC TGC CCG AAG TAC ATC GAC -3’ Mồi ngược U2L: 5’- GAG CTC CAG ATG CCG TGA CG -3’[67]

Chu trình nhiệt: 940C - 4 phút 940C - 30giây 550C - 15 giây 35 chu kỳ 720C - 1 phút 720C - 10 phút 40C -

Phân loại dựa trên trình tự gen 16S rRNA

Phản ứng PCR được sử dụng để khuếch đại đoạn gen ADNr 16S với cặp mồi (27F: (5'- AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG -3') và 1525R (5'- AAAGGAGGTGATCCA GCC-3')[65]. Chu trình nhiệt: 950C - 3 phút 950C - 30giây 560C - 15 giây 30 chu kỳ 720C - 1 phút 720C - 5 phút 40C -

- Kiểm tra các sản phẩm của PCR bằng điện di

Tinh sạch sản phẩm PCR

 Sử dụng bộ kit QIAgen theo chỉ dẫn của nhà sản xuất.

- Thêm dung dịch PBI vào mẫu theo thể tích 5:1. Trộn đều. - Cho hỗn hợp mẫu vào cột, ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút . - Đổ bỏ dịch phía dưới cột.

- Bổ sung 750 l PE buffer lên cột. Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút - Đổ bỏ dịch dưới cột

- Ly tâm tiếp 10.000 v/p trong 1 phút - Chuyển cột sang ống Eppendoft mới

- Thêm 30l nước. Để ở nhiệt độ phòng 5 phút - Ly tâm 10.000 v/p trong 1 phút

- Lấy dịch phía dưới.  Kiểm tra độ tinh sạch của mẫu:

Mẫu được kiểm tra trên máy quang phổ ở các bước sóng 260 và 280. Tính tỷ lệ tinh sạch : OD 260/OD 280 > 1,7

Phản ứng khuếch đại DNA cho đọc trình tự

-Terminator Ready Reaction Mix (Termix):

Buffer 5X 9l

Bigdye Ready Reaction premix 18l

H2O 9l

-Thành phần phản ứng PCR cho đọc trình tự: Termix 8l

Mồi (*) 1l

ADN khuôn 1l ( nồng độ ADN là 40-60g/ml)

H2O 10l (*) Các loại mồi sử dụng: 27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'. 1525R: 5'-AAAGGAGGTGATCCAGCC-3'. 780F: 5'-GAATTGATACCCTGGTAG-3.' 350R: 5'-CTGCTGCCTCCCGTAG-3'. 1100F: 5'-GCAACGAGCGCAACCC-3'. 920R: 5'-GTCAATTCCTTTGAGTTT-3'. -Chu trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại gen cho đọc trình tự:

960C - 1phút 960C - 10giây

500C - 5 giây 25 chu kỳ

600C - 4 phút

3.2.1.5. Tinh sạch sản phẩm PCR cho đọc trình tự

- Chuyển 20l sản phẩm sang ống Eppendoft sạch

- Thêm 5l EDTA 125mM và 60l ethanol 100%. Để khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng.

- Ly tâm 15.000v/p, 15phút

- Làm khô.

- Thêm 10l HiDi Formamide

- Để ở 960C trong 2 phút

- Cho ngay mẫu vào nước đá lạnh

- Chuyển toàn bộ mẫu vào giếng trong khay dùng cho đọc trình tự.

- Vận hành máy xác định trình tự gen ABI 3100Avant Giải trình tự gen 16S rRNA và xây dựng cây phát sinh chủng loại

Trình tự của ADNr 16S được phân tích sử dụng phần mềm CLUSTAL W ver 1.83 của Thompson và cộng sự (1997) [59]. Các trình tự tham khảo dùng trong

nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL, GenBank. Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980) [32] sử dụng phương pháp của Saitou và Nei (1987) [53]. Phân tích bootstrap được thực hiện từ 1000 lần lặp lại

ngẫu nhiên, chỉ có những giá trị trên 50% được thể hiện.

2.4.3. Nghiên cứu đặc tính probiotic và tuyển chọn chủng

2.4.3.1. Khả năng sinh enzyme ngoại bào

Phương pháp đặt thỏi thạch

Cấy các chủng vi khuẩnBifidobacteriumtrên môi trường thạch MRSc, ở 37oC sau 3 ngày. Dùng ống hút có đường kính 5mm khoan các thỏi thạch chứa khuẩn lạc đặt lên các bản thạch chứa các cơ chất (Casein, CMC, tinh bột, tributyrin). Quan sát vòng trong xung quanh các thỏi thạch trên các đĩa chứa casein và tributyrin. Tráng Lugol vào các đĩa chứa CMC và tinh bột. Đo vòng phân giải.

Phương pháp nhỏ dịch

Cấy các chủng vi khuẩn Bifidobacterium trên môi trường dịch thể MRSc, ở 37oC sau 3 ngày, sau đó ly tâm 1 ml dịch nuôi của từng chủng (10.000 v/p, 10 phút trong ống eppendorf 1,5 ml). Đổ các bản thạch chứa các cơ chất 0,1% (Casein, CMC, Tinh bơt, Tributyrin). Dùng ống hút có đường kính 5mm khoan các lỗ giếng, nhỏ phần dịch trong sau ly tâm vào các lỗ tương ứng của mỗi chủng trên đĩa môi trường

chứa cơ chất. Ủ 37oC sau 1 ngày, quan sát vòng trong xung quanh các lỗ giếng trên các đĩa chứa casein và tributyrin. Tráng Lugol vào các đĩa chứa CMC và tinh bột. Đo vòng phân giải.

2.4.3.2. Khả năng sinh trưởng

 Khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn được xác định bằng mật độ tế bào trong dịch ni (OD ở bước sóng 600nm).

 Xác định số lượng tế bào (CFU/ml,g): Lấy 10 ml (g) mẫu cần xác định số lượng tế bào pha vào 90 ml nước muối sinh lý (NaCl 0,85%). Pha lỗng tới nồng độ thích hợp theo hệ số 10. Sau đó, nhỏ vào các đĩa mơi trường thích hợp cho mỗi loại (mỗi đĩa nhỏ 100l, mỗi nồng độ pha loãng làm 3 đĩa), dùng que gạt trải đều cho đến khi khơ mặt thạch; Các đĩa Petri sau đó được ni 37oC trong bình kín ở điều kiện kỵ khí sử dụng túi tạo kỵ khí (Sachet gaspak EZ anaerobe, Becton Diskinson). Sau 2 ngày nuôi ở 37oC, tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc tại nồng độ pha lỗng thích hợp (>30 khuẩn lạc/ đĩa Petri).

Số lượng tế bào/g được tính theo cơng thức = a x b x c

Trong đó: a-số lượng khuẩn lạc trên đĩa; b- nồng độ pha loãng; c- lượng mẫu cấy

2.4.3.3. Khả năng sinh axít hữu cơ

Định lượng axit theo Therner [22]

Các chủngBifidobacteriumđược nhân khởi động 24 giờ trên môi trường MRS dịch thể, 10% giống khởi động được cấy truyền sang môi trường MRSc dịch thể, ủ 24 giờ. Lấy 10ml dịch nuôi vi khuẩn đã li tâm 12.000 v/p, 10 phút, bỏ sinh khối, thêm 1 giọt phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn 900). Sau đó chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giây thì dừng lại. Ghi lại thể tích NaOH (ml) đã dùng. Độ axit được tính như sau:

2.4.3.4. Khả năng chịu muối mật

Mơi trường thạch MRSc được bổ sung muối mật ở các nồng độ: 0,3% ; 0,5% và 1%. 10 µl dịch tế bào của các chủng BifidobacteriumOD ≈ 1,8 được nhỏ lên các bản thạch chứa các nồng độ muối mật và ủ ở 37oC trong điều kiện kỵ khí, đọc kết quả sau 24-48 giờ. Đánh giá mức độ sinh trưởng của từng chủng qua lượng tế bào mọc trên mỗi bản thạch[37].

2.4.3.5. Khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh đường ruột

- Phương pháp khuếch tán trên thạch

Các chủng Bifidobacterium được cấy từ ống nghiệm sang ống môi trường khác chứa môi trường MRS dịch và ủ ở 37oC, trong 48 giờ. Dịch nuôi của các chủng được ly tâm riêng ở 10.000 v/p trong 10 phút. Dịch nổi qua ly tâm được chia 2 phần: phần 1 dùng để xác nhận khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh từ dịch nuôi và phần 2 dùng cho xác nhận khả năng sản sinh bacteriocin kháng khuẩn bằng cách chỉnh về pH trung tính.

Dịch ni 24 giờ của các vi khuẩn kiểm định Escherichia coli, Salmonella enteric, Staphylococcus aureus, Miccrococcus luteus) trên môi trường NA. Lấy tăm

bông vô trùng nhúng vào dịch nuôi vi khuẩn kiểm định gạt đều trên bề mặt của đĩa thạch NA. Các đĩa được để khô và dùng ống nhựa vơ trùng có đường kính (5 mm) đục lỗ tạo các giếng trên mơi trường thạch. Mỗi giếng được nhỏ 60 µl dịch lọc của các chủng Bifidobacterium. Sau khi ủ 37C trong 24 giờ quan sát vịng vơ khuẩn xung quanh các giếng. Kết quả dương tính khi đường kính vịng ức chế >1 mm[37].

2.4.3.6. Khả năng tồn tại trong điều kiện đường tiêu hóa của dịch dạ dày và ruột mơphỏng phỏng

Khả năng chịu được dịch đường tiêu hóa ở dạ dày (pH3 và pepsin) và ruột (pH8 và pancreatin) của các chủng Bifidobacterium được thí nghiệm theo phương pháp của Jamaly và cộng sự (2011) có thay đổi. Ni chủng Bifidobacterium ở pha ổn định trên môi trường MRSc dịch thể. Ly tâm 10.000 v/p trong 20 phút ở 4oC, rửa cặn tế bào 2 lần, sau đó hịa vào 3ml đệm phosphate pH 6,5, xác định mật độ tế bào

ban đầu (CFU/ml). Hút 1 ml dịch tế bào đã hòa đệm ở trên vào 9 ml dịch dạ dày, bao gồm: NaCl (125 mM), KCl (7 mM), NaHCO3 (45 mM), và pepsin (3 g/l). Dùng dịch 1M HCl để chỉnh pH về 3,0. Ủ 4 giờ ở pH 3,0, ở điều kiện kị khí tại 37°C, xác định mật độ tế bào (CFU/ml). Hút 1ml dịch sau khi ủ 4 giờ vào 9 ml dịch tiết tá tràng nhân tạo (pH 8) gồm (g/l ): NaHCO3-6,4; KCl- 0,239; NaCl-1,28, muối mật-5 và pancreatin-1; Dùng NaOH 1M để chỉnh pH về 8,0, sau 16 giờ xác định mật độ tế bào (CFU/ml) (CFU/ml)[13].

2.4.3.7. Khả năng chịu kháng sinh

Phương pháp khuếch tán trên thạch có thay đổi theo phương pháp của Leite và cộng sự (2015). Đổ 15 ml MRSc agar vào đĩa, phủ lên trên bằng 5 ml thạch mềm có chứa 200 μL chủng Bifidobacterium ở nồng độ 109CFU/ml. Các mẩu giấy được tẩm các loại kháng sinh (ampicillin, amoxicillin, cephalexin, cloramphenicol, erythromycin, gentamycin, kanamycin, penicillin G, streptomycin, tetracycline- 10μg/ml) và đặt vào đĩa đã cấy Bifidobacterium. Đĩa này sau đó được ủ kỵ khí ở

37°C trong 24 giờ. E. coli làm ĐC được ủ hiếu khí ở 37°C. Đường kính vùng ức chế được đo[37].

2.4.4. Lựa chọn điều kiện ni cấy thích hợp cho các chủngBifidobacterium

2.4.4.1. Lựa chọn mơi trường ni thích hợp

Các chủng vi khuẩn Bifidobacterium được cấy vào 7 loại môi trường (MT1, MT2, MT3, MT4, MT5, MT6, MT7) trong các ống nghiệm có nút cao su và kẹp xốy. Các ống nghiệm này được đặt ở tủ ổn nhiệt 37 C. Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn thông qua giá trị OD 600 của dịch nuôi.

2.4.4.2. Lựa chọn nhiệt độ ni thích hợp

Cấy chủng vi khuẩn vào mơi trường ni cấy thích hợp đã được lựa ở các nhiệt độ khác nhau: 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 37oC, 40oC, 45oC, 50oC, 55oC. Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn thông qua giá trị OD 600 của dịch ni.

2.4.4.3. Lựa chọn pH ni thích hợp

Cấy chủng vi khuẩn vào mơi trường ni cấy thích hợp và nhiệt độ đã được lựa chọn ở dải pH từ 4-9. Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn thông qua giá trị OD 600 của dịch nuôi.

2.4.4.4. Lựa chọn nguồn cacbon ni thích hợp

Chủng vi khuẩn được ni vào mơi trường dịch thích hợp đã được lựa chọn trong các ống nghiệm có nút cao su và kẹp xốy. Thay nguồn cacbon đối chứng dương chứa glucose bằng fructose, galactose, maltose, mannitol, saccharose, lactose, tinh bột. Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn thông qua giá trị OD 600 của dịch ni.

2.4.4.5. Lựa chọn nguồn Nitơ ni thích hợp

Chủng vi khuẩn được ni vào mơi trường dịch thích hợp đã được lựa chọn trong các ống nghiệm có nút cao su và kẹp xoáy. Thay nguồn nitơ đối chứng dương hỗn hợp trong môi trường MRS bằng các nguồn: cao men, cao malt, cao thịt, casein, peptone, triptone, (NH4)2SO4, Ure, NaNO3, NaNO2. Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn thông qua giá trị OD 600 của dịch ni.

2.4.4.6. Lựa chọn thời gian ni thích hợp

Chủng vi khuẩn được ni vào mơi trường dịch thích hợp đã được lựa chọn trong các ống nghiệm có nút cao su và kẹp xốy và ni vi khuẩn theo các điều kiện ni thích hợp. Sau thời gian 0, 8, 16, 24, 36, 40, 48 và 60 giờ nuôi. Xác định mật độ tế bào, pH và hàm lượng đường cịn lại trong dịch ni.

Phương pháp định lượng Glucose[57]

Hóa chất  DNS (Merck)  RO salt (Merck)  NaOH (Merck)  Phenol tinh thể  NaHCO3  Tinh bột tan  Tris-base

 HCl

 D- glucose 1. Pha thuốc thử DNS

 Dung dịch A

Dung dịch DNS 1%: Cân 4g DNS hòa tan trong 400 ml nước cất Cân 127,5g RO salt hòa tan trong DNS 1%

NaOH 4,5%: Cân 6,75g NaOH hòa tan trong 150 ml nước cất Trộn dung dịch trên được dung dịch A,màu vàng,trong suốt.  Dung dịch B

NaOH 10%: cân 1,1g NaOH hòa tan trong 10 ml nước cất

Cân 5g phenol tinh thể hòa tan trong NaOH 10%. Rồi dẫn nước đến 50ml Cân 3,45 g NaHCO3 hòa tan trong 34,5 ml dung dịch phenol ở trên, thu được dung dịch B

Trộn 2 dung dịch A và B vào bình tối màu 2 ngày là dung được Chú ý: nếu dung dịch xuất hiện tủa phải dùng giấy lọc.

2. Dựng đường chuẩn glucose

D-glucose được sấy khô ở 105oC trong 2 giờ. Cân 0,2g D- glucose trong 10ml nước cất - được stock solution 20mg/ml.Hút 1ml stock solution vào 9ml nước cất – được stock solution 1 có nồng độ 1 có nồng độ 2 mg/ml. Dùng stock solution 1 để pha loãng thành các dãy nồng độ sau từ 0; 0,2; 0,4;…; 2 mg/ml.

Cách dựng đường chuẩn

 Hút 0,2 ml dung dịch đường D-glucose ở các nồng độ khác nhau cho vào các ống nghiệm định lượng.

 Bổ sung 0,6 ml DNS

 Đun sơi hỗn hợp trong vịng 5 phút  Làm lạnh nhanh trong nước đá 5 phút

 Để hỗn hợp có nhiệt độ bằng nhiệt độ phịng, bổ sung 4,2 ml nước cất.