Từ kết quả hình 3.10 và 3.11 cho thấy ở tốc độ ni 20 vịng/phút chủng Bf 3.1 có giá trị OD 600 cao nhất đạt 2,214, tuy nhiên mật độ tế bào của chủng Bf 3.1 đạt giá trị cao nhất ở tốc khuấy 10 vịng/phút, với giá trị là 7,6×109 CFU/ml. Cịn đối với chủng Bf 9.2 có mật độ tế bào đạt cao nhất ở tốc độ khuấy 30 vòng trên phút và số lượng tế bào cao nhất ở tốc độ 20 vịng/ phút với giá trị là 8,5×109CFU/ml.
Điều này có thể giải thích bởi các chủng là chủng kỵ khí, chế độ khuấy của thiết bị lên men chỉ là để đảo trộn chủng giống với môi trường nuôi đề đảm bảo các
tế bào vi khuẩn tiếp xúc đều với chất dinh dưỡng trong mơi trường, vì vậy 2 chủng này chỉ sinh trưởng tốt ở tốc độ đảo trộn thấp dưới 30 vòng/phút. Còn việc mật độ tế bào giảm mặc dù giá trị OD 600 cao, có thể là do ở cùng thời gian nuôi việc khuấy đảo nhanh khiến hai chủng này phát triển quá nhanh, chuyển dần sang pha lag trong chu kỳ sinh trưởng khiến mật độ tế bào sống giảm. Từ kết quả trên chúng tôi lựa chọn tốc độ khuấy thích hợp cho 2 chủng Bf 3.1 và Bf 9.2 lần lượt là 10 và 20 vòng/phút.
3.4.2. Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp
Hai chủng Bifidobacterium bifidumBf 3.1, Bifidobacterium animalisBf 9.2 được nuôi trên thiết bị lên men 5 lit, với tốc độ khuấy đã được tối ưu ở trên, thay đổi tỷ lệ giống cấy ở các nồng độ 1%, 2%, 5%, 10%, 15%. Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn thơng qua giá trị OD 600.
Hình 3.12:Lựa chọn tỷ lệ giống cấy thích hợp cho hai chủng Bifidobacterium
Từ kết quả hình 3.12 cho thấy cả hai chủng Bf 3.1 và 9.2, đều đạt giá trị OD600 cao nhất ở tỷ lên giống 5% với giá trị lần lượt là 2,335 và 2,455. Từ kết quả trên chúng tối lựa chọn tỷ lệ giống thích hợp cho 2 chủng này là 5%.
3.4.3. Lựa chọn thời gian ni thích hợp
Giữ nguyên các điều kiện ni thích hợp ở trên, thay đổi thời gian ni hai chủng Bf 3.1 và Bf 9.2 ở các giá trị thời gian khác nhau: 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ 60 giờ, 72 giờ. Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn thông qua giá trị OD 600 và xác định số lượng tế bào của dịch ni.
Hình 3.13:Lựa chọn thời gian ni thích hợp cho chủng Bf 3.1 quy mơ 5 lít
Hình 3.14:Lựa chọn thời gian ni thích hợp cho chủng Bf 9.2 quy mơ 5 lít
Từ kết quả hình 3.13 và 3.14 cho thấy, chủng Bf 3.1 có giá trị OD 600 cao nhất sau 48 giờ nuôi, nhưng số lượng tế bào đạt cao nhất ở 24 giờ đạt 8×109CFU/ml, sau đó giảm dần sau 36 giờ ni. Khác với chủng Bf 3.1, chủng Bf 9.2 có số lượng tế bào cao nhất sau 36 giờ nuôi cấy đạt 9,1×109CFU/ml, giảm mạnh sau 48 giờ ni.
3.5. Lựa chọn chất mang thích hợp cho hai chủngBifidobacterium
Bảng 3.9:Khả năng tồn tại của 2 chủng nghiên cứu trên 4 loại chất mang
Chủng Bf 3.1 Bf 9.2
OD 600 2,358 2,497
Mật độ ban đ u (CFU/ml) 8,5×109 9,6×109
Mật độ sau khi sấy (40oC) (CFU/ml) Glucose 1,5×105 2,2×105 Lactose 5,3 ×104 6,1 ×104 Skim 7,6×108 8,1×108 Tinh bột 2×109 2,5×109
Mật độ sau khi bảo quản 1 tu n (4oC) (CFU/ml) Glucose 1,5×104 4,2×104 Lactose 1,2 ×103 3,4 ×103 Skim 1,6×107 1,4×108 Tinh bột 2×109 2×109
Mật độ sau khi bảo quản 2 tu n (4oC) (CFU/ml) Glucose 1,5×103 1,5×103 Lactose 5,3 ×102 5,3 ×102 Skim 1,2×107 2,4×107 Tinh bột 1×109 1,5×109
Mật độ sau khi bảo quản 3 tu n (4oC) (CFU/ml) Glucose 1,7×102 3,6×102 Lactose KPH KPH Skim 2,3×106 3,6×106 Tinh bột 1,6×108 2×108
Mật độ sau khi bảo quản 4 tu n (4oC) (CFU/ml) Glucose KPH KPH Lactose KPH KPH Skim 4,3×105 1,7×105 Tinh bột 6,5×107 7,2×107
Dựa vào kết quả bảng 3.9cho thấy, khả năng tồn tại của hai chủng nghiên cứu giảm dần theo thời gian bảo quản. Sau 4 tuần, hai chủng nghiên cứu đều không thấy xuất hiện trên 2 loại chất mang glucose và lactose. Chất mang tinh bột tan là chất mang thích hợp cho q trình sấy khơ và bảo quản hai chủng Bf 3.1 và Bf 9.2, với số lượng tế bào cịn lại sau 4 tuần lần lượt là 6,5×107và 3,2×107CFU/ml.
KẾT LUẬN
Phân lập được 15 chủng Bifidobacterium từ các nguồn khác nhau tại Việt Nam dựa vào quan sát hình thái tế bào, so sánh với gen mã hóa enzyme F-6-PPK và phân tích trình tự rDNA 16S, trong đó 7 chủng (Bf 1.1; Bf 3.2; Bf 4.3; Bf 5.1; Bf 7.3; Bf 8.2; và Bf 9.2) được định tên là Bifidobacterium animalis subsp. lactis; 4 chủng Bf 4.1; Bf 5.2; Bf 6.2 và Bf 7.4 thuộc loài Bifidobacterium longum và 4 chủng Bf 2.1; Bf 3.1; Bf 4.2 và Bf 6.1 được định tên làBifidobacterium bifidum.
Từ 20 chủng vi khuẩn Bifidobacterium (15 chủng mới phân lập và 5 chủng đang lưu giữ tại VTCC) đã lựa chọn được 2 chủng Bifidobacterium bifidum Bf 3.1 và
Bifidobacterium animalis subsp.lactisBf 9.2 mang các đặc tính probiotic tốt để sử dụng trong sản xuất chế phẩm: sinh trưởng tốt, sinh enzyme ngoại bào; có khả năng chịu muối mật, khả năng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh đường ruột, khả năng sinh axit hữu cơ và khả năng chịu các điều kiện khắc nghiệt trong đường tiêu hóa mơ phỏng và nhạy cảm với 10 loại kháng sinh thông dụng ở nồng độ thấp.
Điều kiện lên men dịch thể thích hợp cho khả năng sinh trưởng cho hai chủng
Bifidobacterium bifidum Bf 3.1 và Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bf 9.2 trong điều kiện phịng thí nghiệm: Ni kỵ khí trong mơi trường MRSc, nhiệt độ 37oC, pH 6,0 nguồn cacbon là glucose và nguồn nitơ là hỗn hợp trong môi trường MRSc; Thời gian ni thích hợp cho chủng Bf 3.1 trong khoảng 24-36 giờ với mật độ tế bịa đạt 6,6×109CFU/ml, cịn đối với chủng chủng Bf 9.2 là 16-24 giờ với mật độ tế bào đạt 8,1×109CFU/ml.
Điều kiện lên men thích hợp trên quy mơ nồi lên men 5 lít của chủng
Bifidobacterium bifidum Bf 3.1 là tốc độ khuấy 10 vòng/phút, tỷ lệ giống cấy 5%, thời gian nuôi 24 giờ, với mật độ tế bào đạt 8×109 CFU/ml. Cịn đối với chủng
Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bf 9.2 là tốc độ khuấy 20 vịng/phút, tỷ lệ giống cấy 5%, thời gian ni 36 giờ, với mật độ tế bào đạt 9,1×109CFU/ml. Tinh bột là chất mang tiềm năng cho hai chủng nghiên cứu.
KIẾN NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp cho 2 chủng Bifidobacterium bifidum Bf 3.1 và Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bf 9.2 trên quy mô lớn hơn (20, 50, 300, 1000 lít,..).
Nghiên cứu hình thức lên men (theo mẻ, lên tục, bán liên tục,...) và thu nhận sinh khối thích hợp (ly tâm, lọc,...).
Tiếp tục nghiên cứu các chất mang thích hợp (lactose, glucose, tinh bơt, skimilk, fructooligo sacharides,trehalose, sorbitol,...) cho q trình đơng khơ sinh khối.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Al-Wendawi S.A., Al-Saady A.A. (2012), “Screening for Bacteriocins Production in Enteric Bifidobacterium Isolates and Study of Some Production Affecting Factors”, Medical Journal of Babylon, 9(2), pp. 386-396.
2. Arunachalam K.D. (1999), “The Role of bifidobacteria in Nutrition”, Medicine, and Technology.Nutrition Research. 19(10), pp. 1559-1597.
3. Beerens H., Gavini F. and Neut C. (2000), “Effect of exposure to air on 84 strains of bifidobacteria”,Anaerobe, 6, pp. 65-67.
4. Begley M., Gahan C.G. and Hill C. (2005), “The interaction between bacteria and bile”, FEMS Microbiology Reviews, 29, pp. 625-651.
5. Bezkorovainy A., Miller-Catchpole R. (1989), Biochemistry and Physiology of Bifidobacteria, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, USA.
6. Biavati B. and Mattarelli P. (2001), "The family Bifidobacteriaceae”, The prokaryotes, pp. 322-382.
7. Biavati B. and Mattarelli P. (2012), “Genus Bifidobacterium”, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, pp. 171–206.
8. Biavati B., Sozzi T., Mattarelli P. and Trovatelli L.D. (1992), “Survival of
Bifidobacterium from human habitat in acidified milk”, Micribiologica, 15, pp.
617-621.
9. Biavati B., Vescovo M., Torriani S. and Bottazzi V. (2000), “Bifidobacteria: History, ecology, physiology and applications”, Annals of Microbiology, 50, pp.
117-131.
10. Bielecka M., Markiewicz L. and Wasilewska E. (2003), “Evaluation of primers applied for PCR identification of Bifidobacteriumspp.”, Polish Journal Of Food And Nutrition Sciences, 12/53(2), pp. 10-16.
11. Breed R.S. and Murray E.G.D. (1957), Bergey’s manual of determinative bacteriology,Baltimore, Williams & Wilkins Co., United States.
12. Buchanan R.E. (1974), Bergey’s manual of determinative bacteriology,
Baltimore, Williams & Wilkins Co., United States.
13. Chenoll E, Casinos B, Bataller E, Astals P, Echevarría J and Iglesias J.R. (2011), “Novel probiotic Bifidobacterium bifidum CECT 7366 strain active against the pathogenic bacterium Helicobacter pylori”, Applied and Environmental Microbiology, 77, pp. 1335–1343.
14. Cotter P.D. and Hill C. (2003), “Surviving the acid test: responses of gram- positive bacteria to low pH”, Microbiology and Molecular Biology Reviews,
67(3), pp. 429-453.
15. Dave R.I., Shah N.P. (1996), “Evaluation of media for selective enumeration of
Streptococcus thermophilus, Lactobacillus ssp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilusand bifidobacteria”,Journal of Dairy Science, 79, pp. 1529–1536.
16. De Vrese M. and Schrezenmeir J. (2008), “Probiotic, prebiotics, and synbiotics”,
Food Biotechnology, 111, pp. 1-66.
17. Degnan B.A. and Macfarlane G.T. (1994), “Effect of dilution rate and carbon availability on Bifidobacterium breve fermentation”, Applied Microbiology and Biotechnology, 40, pp. 800-805.
18. Degnan B.A. and Macfarlane G.T. (1995), “Arabinogalactan utilization in continuous cultures of Bifidobacterium longum: Effect of co-culture with Bacteroides thetaiotaomicron”, Anaerobe, 1, pp. 103-112.
19. Devries W. and Stoutham A. (1968), “Fermentation of glucose lactose galactose mannitol and xylose by bifidobacteria”,Journal of Bacteriology, 96, pp. 472-478.
20. Dong X.Z., Xin Y.H., Jian W.Y., Liu X.L. and Ling D.W. (2000), “Bifidobacterium thermacidophilumsp nov., isolated from an anaerobic digester”,
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology , 50, pp. 119- 125.
21. Egan M., O'Connell Motherway M., Ventura M. and van Sinderen M. (2014), “Genetics and Molecular Biology Metabolism of Sialic Acid by Bifidobacterium
breve UCC2003”, Applied and Environmental Microbiology, 80(14), pp. 4414- 4426.
22. Emanuel V., Adrian V., Ovidiu P. and Gheorghe C. (2005), “Isolation of a
Lactobacillus plantarum strain used for obtaining a product for the preservation of fodders”,African Journal of Biotechnology, 4(5), pp. 403-408. 23. FAO/WHO (2002), Joint FAO/WHO working group report on drafting
guidelines for the evaluation of probiotic in food, London, Ontario, Canada.
24. Felis G.E. and Dellaglio F. (2015), "Taxonomy of Lactobacilli and Bifdobacteria",Current Issues in Intestinal Microbiology, 8, pp. 44–61.
25. Gabor E.M., Vries E.J.D., Janssen D.B. (2003), “Efficient recovery of environmental DNA for expression cloning by indirect extraction method”,
FEMS Microbiology Ecology, 44(2), pp. 153–163.
26. Ghouri Y.A., Richards D.M., Rahimi E.F., Krill J.T., Jelinek K.A., DuPont A.W. (2014), "Systematic review of randomized controlled trials of probiotic, prebiotics, and synbiotics in inflammatory bowel disease", Clinical and Experimental Gastroenterology, 7, pp. 473–487.
27. Gibson G.R. and Roberfroid M.B. (1995), "Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota: Introducing the Concept of Prebiotics", The Journal of Nutrition, 125(6), pp. 1401-1412.
28. Harmsen H.J.M., Wildeboer-Veloo A.C. and Raangs G.C. (2000), “Analysis of intestinal flora development in breast-fed and formula-fed infants by using molecular identification and detection methods”, Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition,30, pp. 61-67.
29. Jian W. (2001), “New approach to phylogenic analysis of the genus
Bifidobacterium based on partial HSP60 gene sequences”. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51, pp. 1633–1638.
30. Kawasaki S., Mimura T., Satoh T., Takeda K. and Niimura Y. (2006), “Response of the microaerophilic Bifidobacteriumspecies,B. boum andB. thermophilum, to
31. Kheirallah Z.M.H., Okda A.Y., Abdelrazek M.M., Abonor M.M., Mabrouk M.I. and Saker E.A.E. (2014), “Optimization of Conditions for Production of Antimicrobial Activity by Bifidobacterium bifidum in Alternative Whey Based Medium”,Middle East Journal of Applied Sciences, 4(4), pp. 949-958.
32. Kimura M. (1980), A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequence, Journal of Molecular Evolution, 16, pp. 111-120.
33. Klaassens E.S. (2007), Exploring the functionality of intestinal bifidobacteria: A postgenomics approach, PhD Thesis. Wageningen University and Research
Centre, The Netherlands.
34. Klare I., Konstabel C., Muller-Bertling S., Reissbrodt R., Huys G., Vancanneyt M., Swings J., Goossens H. and Witte W. (2005), “Evaluation of New Broth Media for Microdilution Antibiotic Susceptibility Testing of Lactobacilli, Pediococci, Lactococci, and Bifidobacteria”, Applied and Environmental Microbiology, 71(12), pp. 8982–8986.
35. Ku S., Park M.S., Ji G.E. and You H.J. (2016), "Review on Bifidobacterium bifidum BGN4: Functionality and Nutraceutical Applications as a Probiotic Microorganism",International Journal of Molecular Sciences, 17(9), pp. 1544.
36. Leahy S.C., Higgins D.G., Fitzgerald G.F. and van Sinderen D. (2005), “Getting better with bifidobacteria”,Journal of Applied Microbiology, 98, pp. 1303-1315.
37. Leite A.M.O., Miguel M.A.L., Peixoto R.S., Ruas-Madiedo P., Paschoalin V.M.F., Mayo B., and Delgado S. (2015), “Probiotic potential of selected lactic acid bacteria strains isolated from Brazilian kefir grains”, Journal of Dairy Science, 98, pp. 3622–3632.
38. Li X., Fu G.F., Fan Y.R., Liu W.H., Liu X.J., Wang J.J. and Xu G.X. (2003), “Bifidobacterium adolescentisas a delivery system of endostatin for cancer gene therapy: Selective inhibitor of angiogenesis and hypoxic tumor growth”, Cancer Gene Therapy - Nature,10(2), pp. 105-111.
39. Masco L., Marco V., Ralf Z.; Geert H. and Jean S (2004), "Polyphasic taxonomic analysis of Bifidobacterium animalis and Bifidobacterium lactis reveals relatedness at the subspecies level: reclassification of Bifidobacterium animalis
as Bifidobacterium animalis subsp. animalis subsp. nov. and Bifidobacterium lactis as Bifidobacterium animalis subsp. lactis subsp. nov.", International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 5(4), pp. 1137–1143.
40. McAuliffe O., Cano R.J., Klaenhammer T.R. (2005), “Genetic analysis of two bile salt hydrolase activities in Lactobacillus acidophilus NCFM”, Applied and environmental microbiology, 71(8), pp. 4925–4929.
41. Meena G.S., Majumdar G.C., Banerjee R., Kumar N., Meena P.K. (2014), “Growth Characteristics Modeling of Mixed Culture of Bifidobacterium bifidum
and Lactobacillus acidophilus using Response Surface Methodology and Artificial Neural Network”,Brazilian Archives of Biology and Technology, 57(6),
pp. 962-970.
42. Meile L., Ludwig W., Rueger U., Gut C., Kaufmann P., Dasen G., Wenger S. and Teuber M. (1997), “Bifidobacterium lactis sp. nov., a moderately oxygen tolerant species isolated from fermented milk”, Systematic and Applied Microbiology, 20, pp. 57-64.
43. Meile L., Rohr L.M., Geissmann T.A., Herensperger M., and Teuber M. (2001), “Characterization of the D-xylulose 5-phosphate/D-fructose 6-phosphate phosphoketolase gene (xfp) from Bifidobacterium lactis”, Journal of Bacteriology, 183, pp. 2929-2936.
44. Parche S., Amon J., Jankovic I., Rezzonico E., Beleut M., Barutcu H., Schendel I., Eddy M.P., Burkovski A., Arigoni F. and Titgemeyer F. (2007), “Sugar transport systems of Bifidobacterium longum NCC2705”, Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology,12, pp. 9-19.
45. Parvez S., Malik K.A., Kang S.A. and Kim H.Y. (2006), “Probiotic and their fermented food products are beneficial for health”, Journal of Applied Microbiology, 100, pp. 1171-1185.
46. Payne J.F., Morris A.E.J., Beers P. (1999). “Evaluation of selective media for the enumeration of Bifidobacterium sp. In milk), Journal of Applied Microbiology,
86, pp. 353–358.
47. Perez P.F., Doré J., Leclerc M., Levenez F., Benyacoub J., Serrant P., Segura- Roggero I., Schiffrin E.J. and Donnet-Hughes A. (2007), “Bacterial imprinting of neonatal immune system: Lesson from maternal cells?”, Pediatrics,119, pp. 724- 732.
48. Piasecka-Jóźwiak K., Rozmierska J., Chabłowska B., Stecka K.M., Skąpska S., Kliszcz M., Szkudzińska-Rzeszowiak E. (2013), “Starter Cultures for Lactic Acid Fermentation of Sweet Pepper, Pattypan Squash and Tomatoes”, Polish Journal Of Food And Nutrition Sciences,63(2), pp. 95-102.
49. Rashid M.H., Togo K., Ueda M. and Miyamoto T. (2007), "Probiotic Characteristics of Lactic Acid Bacteria Isolated from Traditional Fermented Milk ‘Dahi’ in Bangladesh", Pakistan Journal of Nutrition, 6(6), pp. 647-652.
50. Reuter G. (1971), “Designation of Type Strains for Bifidobacterium Species”,
International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 21, pp. 273-
275.
51. Roissard F. and Luquet M. (1994), “Bactéries lactiques : Aspects fondamentaux et technologiques”,Uriage Lorica, 1, pp. 380-410.
52. Ruas-Madiedo P. and de Los Reyes-Gavilán C.G. (2005), “Invited Review: Methods for the Screening, Isolation and Characterization of Exopolysaccharides Produced by Lactic Acid Bacteria”, Journal of Dairy Science, 88(3), pp. 843-
856.
53. Saitou N. and Nei M. (1987), “The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees”,Molecular Biology and Evolution, 4, pp. 406-
425.
54. Schell M.A., Karmirantzou M., Snel B., Vilanova D., Berger B., Pessi G., Zwahlen M.C., Desiere F., Bork P., Delley M., Pridmore R.D. and Arigoni F. (2002), "The genome sequence of Bifidobacterium longumreflects its adaptation
to the human gastrointestinal tract", Proceedings of the National Academy of Sciences, 99(22), pp. 14422–14427.
55. Shah S.K. (2007), “Dietary Factors in the Modulation of Inflammatory Bowel Disease Activity”.Medscape General Medicine, 9(1), pp. 60-93.
56. Simpson P.J., Ross R.P., Fitzgerald G.F. and Stanton C. (2004), “Bifidobacterium psychraerophilum sp. nov. and Aeriscardovia aeriphila gen.