II- THIẾT BỊ TUYỂN CỦA PHƯƠNG PHÁP TUYỂN
thơng qua Agrobaterium tulefaciens
NGUYỄN THỊ NHÃ2, TRỊNH THỊ VÂN ANH1, NGUYỄN NGỌC UYÊN TRINH1 VÕ THỊ XUÂN TRANG1, MAI VĂN HÀO1, TRỊNH MINH HỢP
VÕ THỊ XUÂN TRANG1, MAI VĂN HÀO1, TRỊNH MINH HỢP1
TÓM TẮT
Từ 2012 đến 2015, Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển nông nghiệp Nha Hố, chúng tôi tiến hành nghiên cứu chuyển gen Vip3A (cấu trúc trong 2 vector pCB:Vip3A và pCAMBIA1300:Vip3A) vào giống bông Coker310, thu được 93 cây chuyển gen thế hệ T0tái sinh sống trong nhà lưới. Sàng lọc, đánh giá các cây chuyển gen này bằng kháng sinh và PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen nptII, hpt và Vip3A, thu được 8 cây vừa kháng kháng sinh, vừa mang gen chọn lọc và gen đích (4 cây mang 2 gen nptII và Vip3A; 4 cây mang 2 gen hpt và Vip3A); trong đó, có 5 cây sinh trưởng phát triển bình thường, có kiểu hình tương đồng với giống gốc và hữu thụ. Phân tích và đánh giá các cây chuyển gen ở thế hệ T0cho thấy, 5 dòng chuyển gen đều kháng kháng sinh và mang đồng thời cả gen chọn lọc và gen đích (dịng CV2, CV3 và CV27 mang 2 gen nptII và Vip3A; dòng V15 và V21 mang 2 gen hpt và Vip3A); 4 dịng có mức độ biểu hiện protein Vip3A cao (OD460>2,0) là CV2, CV3, V15 và V21; 3 dịng có khả năng kháng cao với cả sâu xanh, sâu khoang và sâu xanh da láng (tỷ lệ gây chết sâu non ≥80% và phần lá bị hại ít ≤3,8 điểm) là CV2, CV3 và V15. Đây là những vật liệu rất quý cung cấp cho chương trình chọn tạo giống bơng kháng sâu trong nước.
hiện trong khn khổ đề tài “Nghiên cứu tạo giống bông kháng sâu và chịu thuốc trừ cỏ bằng kỹ thuật chuyển gen” thuộc Chương trình KC.06.11- 15.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNGPHÁP NGHIÊN CỨU PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Giống bông sử dụng để chuyển gen là Coker310, nhập nội từ Mỹ và đang được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu chuyển gen thông qua A. tumefaciens trên thế giới.
- Vi khuẩn A. tumefaciens chủng C58 mang vector biểu hiện pCAMBIA1300:Vip3A và pCB:Vip3A. Chủng vi khuẩn mang vector chuyển gen là sản phẩm của đề tài “Nghiên cứu tạo giống bông kháng sâu và chịu thuốc trừ cỏ bằng kỹ thuật chuyển gen” do nhóm các nhà khoa học ở Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật - Viện Công nghệ sinh học thiết kế.
- Các oligonucleotit dùng làm mồi cho phản ứng PCR để xác định sự có
mặt của gen chuyển trong cây chuyển gen được thiết kế dựa trên trình tự gen đích Vip3A, gen hpt kháng hygromycin trong vector biểu hiện pCAMBIA1300:Vip3A và gen nptII kháng kanamycin trong vector biểu hiện pCB:Vip3A (Bảng 2.1).
- Kháng thể đặc hiệu cho phản ứng Elisa xác định mức độ biểu hiện của protein Vip3A do Công ty Biocentery, Quảng Đông, Trung Quốc cung cấp.
- Sâu non sâu xanh, sâu khoang và sâu xanh da láng ở tuổi 1 dùng để đánh giá khả năng kháng sâu của cây chuyển gen.
2.2.Phương pháp nghiên cứu