II- THIẾT BỊ TUYỂN CỦA PHƯƠNG PHÁP TUYỂN
thơng qua Agrobaterium tulefaciens
2.2.2. Phương pháp sàng lọc và đánh giá cây chuyển gen
và đánh giá cây chuyển gen Vip3A
- Đánh giá khả năng kháng kháng sinh hygromycin và kanamycin của cây chuyển gen: Được thực hiện theo công bố của Trịnh Minh Hợp và đồng tác giả (2013) [2,3]. Cây bông chuyển gen thế hệ T0 và TKNL sinh trưởng đến giai đoạn 3-4 lá thật được bôi dung dịch hygromycin nồng độ 1.500 mg/l (với pCAMBIA1300:Vip3A) hoặc kanamycin nồng độ 5.000 mg/l (với pCB:Vip3A) lên bề mặt lá vừa xòe bản và quan sát biểu hiện của lá với kháng sinh.
- Tách chiết ADN tổng số từ lá bông non: ADN tổng số của cây chuyển gen được tách chiết từ lá non theo quy trình của Li et al.(2001) [1]. Mẫu mô thực vật tươi (100 mg) được nghiền trong nitơ lỏng, sau đó bổ sung 500 µl dung dịch CTAB 3% (có chứa RNase 40 mg/ml) và ly tâm ở 13.000 vịng/phút để thu dịch nổi. 500 µl chloroform:isoamyl (24:1) được bổ sung vào dung dịch để kết tủa protein. Hỗn hợp sau đó được ly tâm ở 13.000 vịng/phút để thu ADN tinh sạch.
- PCR kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện gen trong cây chuyển gen: Phản ứng PCR được thực hiện với các cặp mồi đặc hiệu được trình bày trong Bảng 2.1. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% để xác định sự có mặt của băng ADN đặc hiệu. Mẫu plasmid pCAMBIA1300: Vip3A và pCB:Vip3A được sử dụng làm đối chứng dương trong phản ứng PCR. Bước kiểm tra PCR được thực hiện với tất cả cây chuyển gen thế hệ T0và T1.
- Elisa kiểm tra mức độ biểu hiện của protein Vip3A trong cây chuyển gen: Mô lá tươi (0,4g) được nghiền trong đệm CBS, sau đó được ly tâm ở 8.000 vòng/phút để thu dịch nổi, hòa tan PVP với dịch nổi đến nồng độ 25 mg/ml. Ly tâm hỗn hợp ở 8.000
Nghiên cu &Trin khai
Bảng 2.1: Trình tự các oligonucleotit dùng trong nghiên cứu
TTTên mồiTrình tựKích thước (bp)
1 hpt-F 5’-TGAACTCACCGCGACGTCTGT-3’ 980 hpt-R 5’-TTTCCACGATCGGCGAGTACTT-3’ 2 npt-F 5’-TCGGCTATGACTGGGCACAACAGA-3’ 800 npt-R 5’-AAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCG-3’ 3 Vip3A-F 5’-GCGGATCCATGAACAAGAATAATACTAA-3’ 2.400 Vip3A-R 5’-CGGAGCTCTTACTTAATAGAGCATCGTA-3’
vòng/phút để thu dịch nổi và chuyển sang vi đĩa, sau đó được bổ sung 150 µl dung dịch CBS. Loại bỏ dung dịch trong vi đĩa, bổ sung 300 µl PBST, rửa rồi loại bỏ dung dịch trong microplate well, lặp lại 3 lần. Sau đó bổ sung 150 µl kháng thể sơ cấp đã pha loãng và ủ ở 370C. Tiếp tục rửa với PBST 3 lần. Bổ sung 150 µl kháng thể thứ cấp đã pha loãng và ủ ở 370C. Rửa với PBST 5 lần và rửa với nước cất 2 lần. Bổ sung 100 µl dung dịch cơ chất. Sau 15-20 phút, dừng phản ứng với 50 µl H2SO42 mol/L. Đo giá trị hấp phụ ở bước sóng 460 nm.
- Đánh giá tính kháng sâu xanh, sâu khoang và sâu xanh da láng: Quy trình như sau:
+ Chuẩn bị nguồn sâu: Thu thập sâu xanh tuổi 4-5 trên cây ngô, nuôi trong điều kiện nhân tạo để sâu sinh trưởng và phát dục tốt. Đến giai đoạn tiền phân hóa nhộng, ngừng cho sâu ăn. Chuyển sâu sang đĩa petri nhựa mới có chứa giấy vụn để sâu làm tổ và hóa nhộng. Khi nhộng vũ hóa, thu trưởng thành theo từng cặp đực và cái. Sau đó, cho 1-2 cặp trưởng thành vào hộp đẻ trứng để chúng giao phối với nhau và đẻ trứng lên tấm vải màn. Đối với sâu khoang và sâu xanh da láng, nguồn là ổ trứng hoặc ổ sâu mới nở thu thập được trên các loại cây không chuyển gen Bt. Khi trứng bắt đầu nở, thu sâu tuổi 1 làm vật liệu nuôi sâu.
+ Nuôi thả cho sâu ăn lá: Ni sâu trong phịng ở nhiệt độ 25-300C và ẩm độ 70%. Sâu được nuôi trong ống nghiệm thủy tinh φ= 3 cm. Thu lá trên các dòng chuyển gen (sinh trưởng phát triển tốt ở giai đoạn ra nụ); đặt 1 sâu tuổi 1 lên mặt dưới của lá; cuốn trịn lá và cho vào trong ống nghiệm; nắp kín ống nghiệm bằng nút bơng bọc vải. Theo dõi và đếm số sâu sống, chết và đánh giá tình hình phát dục của sâu. Mơ tả đặc tính kháng sâu của các cây chuyển gen; đặc điểm sâu chết, sâu sống sót khi ăn lá cây chuyển gen. Trong đó:
- Tỷ lệ sâu chết (%)=(tổng số sâu chết ở các tuổi : số sâu nuôi) x 100
- Đặc điểm lá bị sâu ăn Xuất hiện một ít vết cắn: 1 Có nhiều vết cắn hoặc một ít lỗ thủng nhỏ: 3
Có nhiều lỗ thủng, diện tích lỗ nhỏ: 5 Có nhiều lỗ thủng, diện tích lớn: 7
3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨUVÀ THẢO LUẬN VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả biến nạp genVip3A và tái sinh cây bông