CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.3. Định lượng một số flavonoid bằng phương pháp HPLC
2.4.3.1. Lựa chọn phương pháp định lượng
Dựa trên các nghiên cứu định tính, định lượng một số flavonoid đối với một số loài thuộc chi Pueraria DC., nhóm nghiên cứu nhận thấy hai chất puerarin, daidzein là hai chất quan trọng trong nghiên cứu các loài này.
Dựa trên điều kiện thực tế và tham khảo chuyên luận Sắn dây trong Dược điển Trung Quốc (2015) [16], phương pháp định lượng của Phạm Quốc Tuấn và cộng sự xây dựng và thẩm định năm 2019 [14], đề tài tiến hành đánh giá hàm lượng hai chất
puerarin và daidzein bằng phương pháp HPLC sử dụng detector tử ngoại với quy trình được mô tả cụ thể như sau:
Chuẩn bị dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,8g mẫu thử (xay qua rây 200µm) vào bình nón nút mài, thêm 25,0mL EtOH 30%, cân xác định khối lượng. Đun hồi lưu 30 phút, để nguội và cân lại, bổ sung lượng dung môi bị mất bằng EtOH 30% và lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45µm và sử dụng dịch lọc làm dung dịch thử.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp: Cân chính xác khoảng 12,5mg puerarin (chất chuẩn) hòa tan trong vừa đủ 25,0ml MeOH (dung dịch A). Cân chính xác khoảng 12,5mg daidzein (chất chuẩn) hòa tan trong vừa đủ 50,0ml MeOH (dung dịch B). Lấy 2,0ml dung dịch A và 2,0ml dung dịch B vào bình định mức 50ml, thêm EtOH 30% đến vừa đủ, lắc đều.
Điều kiện sắc ký: Tiến hành chạy sắc kí trên hệ thống HPLC JASCO với cột Kinetex ® EVO C18 (150 x 4,6mm; 5µm), detector: UV 4070. Hệ dung môi pha động: MeOH – H2O theo chương trình gradient (0 – 7 phút: 25% MeOH, 7 – 15 phút: 25% - 60% MeOH, 15 – 20 phút 60% -25% MeOH, 20 – 25 phút 25% MeOH). Tốc độ dòng: 1,0ml/phút. Detector UV phát hiện tại bước sóng 250 nm. Nhiệt độ cột: 40°C. Thể tích mẫu tiêm: 20 µl.
Hàm lượng (%) puerarin và daidzein trong mẫu thử tính theo khối lượng khô được xác định theo công thức:
%𝑃𝑈𝑅 = 𝑆𝑇1 × 𝑚𝑃𝑈𝑅 × 𝑎
25 × 𝑆𝑃𝑈𝑅 × 𝑚𝑐 × (100 − 𝑥) (%)
%𝐷𝐴𝐷 = 𝑆𝑇2 × 𝑚𝐷𝐴𝐷 × 𝑏
50 × 𝑆𝐷𝐴𝐷 × 𝑚𝑐 × (100 − 𝑥) (%)
Trong đó:
%PUR là hàm lượng puerarin trong mẫu thử (%) %DAD là hàm lượng daidzein trong mẫu thử (%)
mPUR và mDADlà khối lượng của puerarin chuẩn và daidzein chuẩn (mg).
ST1 và ST2 là diện tích pic của puerarin và daidzein trên sắc kí đồdung dịch thử (µV.s). SPUR và SDAD là diện tích pic của puerarin và daidzein trên sắc kí đồ dung dịch chuẩn (µV.s). mc là lượng mẫu thử đã cân (mg).
x là hàm ẩm của dược liệu (%)
2.4.3.2. Thẩm định phương pháp định lượng
Phương pháp định lượng được tiến hành thẩm định một số chỉ tiêu: Tính thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng và độ chụm theo hướng dẫn của AOAC.
Tính thích hợp hệ thống
Tiến hành sắc ký dung dịch chuẩn hỗn hợp đã chuẩn bị ở trên (mục 2.4.3.1), tiêm lặp lại 6 lần. Xác định pic puerarin và daidzein trên sắc ký đồ ghi lại các thông số: thời gian lưu (tR), diện tích pic (S), độ phân giải (RS), số đĩa lý thuyết (N), hệ số đối xứng (SF).
Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của tR ≤ 1,0%; RSD của S, N, RS, SF ≤ 2,0%. SF của pic chính phải trong khoảng 0,8 - 1,5 (0,8 ≤ SF ≤ 1,5). RS giữa pic chính và pic phụ không dưới 1,5 (RS ≥ 1,5).
Độ đặc hiệu
Phân tích sắc ký mẫu trắng, dung dịch chuẩn hỗn hợp, chuẩn độc lập và dung dịch thử. Xác định pic các chất cần phân tích trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Dung dịch chuẩn hỗn hợp và dung dịch thử được chuẩn bị như mô tả trong mục 2.4.3.1. Mẫu trắng là dung dịch EtOH 30% trong nước. Các dung dịch chuẩn độc lập được chuẩn bị bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc (dung dịch A và dung dịch B) 25 lần bằng EtOH 30%.
Yêu cầu: Sắc ký đồ của mẫu trắng không xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Nếu có, đáp ứng pic phải ≤ 2,0% so với đáp ứng của pic mẫu chuẩn. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp phải cho pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu trên sắc ký đồ của riêng từng chất chuẩn. Trên sắc ký đồ của mẫu thử phải cho pic với thời gian lưu tương ứng như pic của chất đó trên mẫu chuẩn.
Khoảng tuyến tính
Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn: Từ dung dịch chuẩn gốc puerarin (dung dịch A) và dung dịch chuẩn gốc daidzein (dung dịch B), tiến hành pha loãng bằng EtOH 30% được dãy dung dịch chuẩn có nồng độ đối với puerarin lần lượt 5,0; 10,0; 15,0;
hành sắc ký theo điều kiện mô tả trong phương pháp và ghi lại sắc ký đồ, xác định diện tích pic của puerarin và daidzein. Vẽ đồ thị biểu diễn và thiết lập phương trình hồi quy của diện tích pic theo nồng độ.
Bảng 2.2. Cách chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn puerarin
Tên dung dịch chuẩn A1 A2 A3 A4 A5
Nồng độ puerarin sau pha loãng 5 10 15 20 25
Thể tích dd puerarin 500µg/ml (ml) 1,0 2,0 3,0 2,0 5,0
EtOH 30% vừa đủ (ml) 100,0 100,0 100,0 50,0 100,0
Bảng 2.3. Cách chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn daidzein
Tên dung dịch chuẩn B1 B2 B3 B4 B5
Nồng độ daidzein sau pha loãng 2,5 5,0 7,5 10,0 12,5
Thể tích dd daidzein 250µg/ml (ml) 1,0 2,0 3,0 2,0 5,0
EtOH 30% vừa đủ (ml) 100,0 100,0 100,0 50,0 100,0
Yêu cầu: Diện tích pic chuẩn phụ thuộc tuyến tính với nồng độ dung dịch với hệ số R2 ≥ 0,99 (r ≥ 0,995).
Độ đúng
Độ đúng của phương pháp được đánh giá qua độ thu hồi xác định được khi thêm một lượng chất chuẩn xác định vào dung dịch thử. Các dung dịch thử thêm chuẩn được chuẩn bị bằng cách cân chính xác một lượng mẫu thử cho vào bình nón đậy kín, thêm một thể tích chính xác dung dịch chuẩn theo hướng dẫn. Thêm một thể tích EtOH 30% bằng 25 - Vchuẩn, đậy chặt nắp và cân. Đun hồi lưu trên bếp cách thủy 30 phút, để nguội và cân lại, bổ sung lượng dung môi bị mất bằng ethanol 30% và trộn đều. Lọc và lấy dịch lọc làm dung dịch thử thêm chuẩn. Mỗi nồng độ chuẩn bị 3 mẫu song song.
Bảng 2.4: Cách chuẩn bị các dung dịch thử thêm chuẩn
Lượng thử (g)
Lượng chuẩn thêm vào (µg/ml) Nồng độ dự kiến dd thử thêm chuẩn (µg/ml) puerarin 0,2 5 10 0,4 5 15 0,6 5 20 daidzein 0,2 2,5 5 0,4 5 10 0,8 5 12,5
Tiến hành sắc ký dung dịch thử, dung dịch chuẩn hỗn hợp và các dung dịch thử thêm chuẩn như điều kiện lựa chọn. Ghi lại diện tích pic để tính độ thu hồi. Độ thu hồi (R) được tính theo công thức:
𝑅 = 𝑚𝑡ì𝑚 𝑙ạ𝑖
𝑚𝑡ℎê𝑚 𝑣à𝑜. 100 (%)
Trong đó:
𝑚𝑡ì𝑚 𝑙ạ𝑖: Là lượng chất chuẩn tìm lại từ mẫu thử thêm chuẩn (mg).
𝑚𝑡ℎê𝑚 𝑣à𝑜: Là lượng chất chuẩn đã thêm vào mẫu thử thêm chuẩn (mg).
Yêu cầu: Độ thu hồi chấp nhận cho trường hợp chất phân tích có hàm lượng trong khoảng 0,01 - 1% là 92,0 - 105,0%. RSD của độ thu hồi tại mỗi mức nồng độ không quá 2,0%.
Độ lặp lại
Độ lặp lại được xác định bằng cách phân tích 6 lần mẫu thử, được chuẩn bị bởi cùng một người, cùng một điều kiện và tiến hành trong ngày.