CHƯƠNG II : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học
2.4.2.1. Định tính flavonoid trong dịch chiết toàn phần bằng phản ứng hóa học
Các mẫu rễ củ được rửa sạch, cắt nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ 50-55°C, làm nhỏ nguyên liệu qua rây 500µm, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô ráo.
Chiết 0,5g bột dược liệu các mẫu rễ củ bằng EtOH 70% trên bếp cách thủy với sinh hàn hồi lưu. Dịch chiết EtOH được bay hơi dung môi cho tới cắn. Cắn được hòa tan lại trong EtOH 95% và được thực hiện các phản ứng định tính [4], [7], [10], [11].
- Phản ứng với dung dịch kiềm: lấy 2ml dịch chiết EtOH, thêm vài giọt NaOH 10%.
- Phản ứng với acid: lấy 2ml dịch chiết EtOH, thêm vài giọt HCl 10%. Quan sát hiện tượng, nếu dung dịch không xuất hiện màu đỏ thì đun nóng dung dịch trên bếp cách thủy.
- Phản ứng Cyanidin – định tính nhóm chất có cấu trúc γ –pyron : thêm vào 2ml dịch chiết EtOH một ít bột magnesi. Thêm từ từ vào hỗn hợp 0,5ml HCl đậm đặc.
- Phản ứng với thuốc thử diazoni: lấy 2ml dịch chiết EtOH kiềm hóa bằng
Quan sát hiện tượng, ghi lại kết quả định tính.
2.4.2.2. Định tính bằng sắc kí lớp mỏng
Tiến hành định tính flavonoid trong các mẫu SD1, SD2, SD3 trên hệ thống HPTLC của Camag.
Các thông số trên hệ thống HPTLC được cố định như sau: - Pha tĩnh: Bản mỏng HPTLC Si 60 F254 (Merck)
- Thông số sắc ký: kích thước vết 8 mm, khoảng cách giữa các vết 11,4 mm, chiều cao vết 8 mm.
- Khoảng cách khai triển: 80 mm. - Thời gian bão hòa: 20 phút
- Kiểm soát độ ẩm: độ ẩm tương đối 33% Cách tiến hành:
- Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác 0,3g bột dược liệu vào bình nón 50 ml. Thêm 20ml MeOH để qua đêm và tiến hành chiết siêu âm trong 15 phút ở nhiệt độ 45°C. Để nguội về nhiệt độ phòng và lọc lấy dịch. Dịch lọc được cô lấy cắn trên bếp cách thủy. Tiến hành hòa cắn trong 1 ml EtOH (TT) làm dung dịch thử.
- Chuẩn bị dung dịch chất chuẩn đối chiếu: Hòa tan puerarin, daidzein chuẩn trong MeOH để thu được 2 dung dịch chuẩn riêng biệt có nồng độ khoảng 0,5mg/ml.
- Hệ dung môi khai triển: CHCl3: MeOH: H2O: HCOOH (60: 12: 2:1)
- Tiến hành sắc ký: chấm riêng biệt một thể tích nhất định dung dịch thử, dung dịch chuẩn. Triển khai sắc ký. Quan sát bản mỏng dưới ánh sáng thường, dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm.