1.4.3 .Các bƣớc của quá trình nhân giống invitro
1.5.Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô vào nhân giống cây hoa Đồng Tiền
cây hoa Đồng Tiền
1.5.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô tế bào vào nhân giống cây hoa Đồng Tiền trên thế giới
* Nghiên cứu về nhân giống nuôi cấy mô tế bào
Theo điều tra nghiên cứu về công nghệ sinh học thực vật trên thế giới ở hoa Đồng Tiền, ngƣời ta có thể sử dụng đỉnh sinh trƣởng, đế hoa, lá, cuống hoa, bầu nhụy, noãn… làm mẫu cấy. Việc tái sinh từ mẫu lá non thành công nhất, khi sử dụng mẫu cấy là đỉnh sinh trƣởng trải qua nhiều giai đoạn để tạo ra một khối lƣợng sinh khối lớn.
Huang LiYun; Li Jie; Chen XiongTing; Zang XiuJuan (2008) đã nghiên cứu tái sinh từ đế hoa của giống hoa Gerbera jamesonli cv. Dahonghua tạo chồi bất định. Nghiên cứu này nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật khác nhau đến sự sinh thái callus và hình thành từ mầm cấy là đế hoa, nghiên cứu đã thiết lập một hệ thống tái sinh có hiệu quả. Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng môi trƣờng tái sinh tối ƣu nhất cho sự cảm ứng hình thành callus là môi trƣờng MS cơ bản có bổ sung 10mg/l BA và NAA. Môi trƣờng MS ÷ 2mg/l BA + 1.0mg/l NAA + 5.0mg AD/litre đƣợc sử dụng cho công việc cảm ứng tạo chồi sau 30 ngày. MS ÷ 2.0mg benzyadenine + 0.5mg NAA/litre đƣợc sử dụng để nhân chồi (nhân nhanh). Môi trƣờng ½ MS có bổ sung 0.2mg IBA/litre là môi trƣờng ra rễ. Bổ sung 30mg/litre Kanamycin vào trong môi trƣờng để bảo quản nguồn gen [25].
* Nghiên cứu về giá thể
Tác giả Bunt (1965), đã sử dụng hỗn hợp cho gieo hạt hoa Phong Lữ (tính theo thể tích) 1 than bùn + 1 cát + 2,4 kg/m3 đá vôi nghiền đều cho cây con mập, khoẻ [23].
Theo JR Keseler, Đại học Auburn (1998), để Phong lữ thảo bền đẹp và hoa lâu tàn thì cần chú ý trong việc lựa chọn kích thƣớc đƣờng kính chậu hợp lý, cắt xén tỉa rễ khi cây sang năm thứ 2, bên cạnh đó để giá thể trồng chậu cũng cần đƣợc thay mới và pH 5,8-6,2. Giá thể tốt cho Phong lữ thảo là phải tơi xốp, nhẹ và thoát nƣớc tốt nhƣ rêu, than bùn, rong biển, đá trân châu, vỏ thông hoặc đất sét nung trộn đều và thêm một ít đá vôi dolomitic, supe lân, các vi chất dinh dƣỡng [30].
Theo George Kueper (2004), xơ Dừa là một sản phẩm cung cấp giá thể tốt cho hoa trồng chậu của Mỹ. Hầu hết xơ dừa đƣợc nhập từ Ấn Độ, SriLanka, Philippines, Indonesia và Trung Mỹ. So với than bùn thì xơ dừa có pH từ 5,5-6,8 và thƣờng chứa các hàm lƣợng kali, natri, clo cao hơn than bùn. Thời gian sử dụng xơ dừa cũng tăng lên gấp 2-4 lần so với than bùn, phân và nƣớc giữ ẩm tốt hơn than bùn vì không có cutin sáp ngăn cản [31].
Tác giả Northen (1974), cho rằng, giá thể gồm 3 phần vỏ thông xay nhuyễn + 1 phần cát (hoặc 8 phần osminda xay nhuyễn) + một phần than vụn, phù hợp cho việc cấy cây phong lan con lấy từ ống nghiệm . Giá thể này cho tỉ lệ sống của cây Lan con cao và sinh trƣởng, phát triển tốt [28].
1.5.2. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng nuôi cấy mô tế bào vào nhân giống cây hoa Đồng Tiền ở Việt Nam
* Nghiên cứu về giống
Theo Đặng Văn Đông (2003), hiện nay ở nƣớc ta có khoảng trên 30 giống hoa đồng tiền, trong sản xuất thƣờng trồng các giống đồng tiền do Hà
Lan lai tạo, nhƣng do các cơ sở Trung Quốc nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào.
- Giống Thanh Tú Giai Nhân (F123)
Là giống có nguồn gốc từ Hà Lan, hoa kép màu cánh sen, nhị màu xanh, đƣờng kính từ 12-15 cm. Cánh hoa ngoài hình thìa, có ba lớp, tiếp đến là một lớp cánh nhỏ hơn, hơi uốn cong vào phía trong. Cuống hoa dài từ 45- 50cm, lá dài màu xanh đậm. Năng suất 50-60 hoa/khóm/năm.
- Giống Thảo Nguyên nhiệt đới (F125)
Là giống có nguồn gốc từ Hà Lan, cánh hoa màu đỏ tƣơi, nhị màu đen, bao quanh nhị là lớp nhụy màu trắng. Cánh hoa gồm ba lớp, đƣờng kính hoa từ 11 - 12cm. Lá ngắn, cây sinh trƣởng phát triển khỏe, năng suất hoa cao (55 - 60 hoa/khóm/năm).
- Giống Kim Hoa Sơn (F142)
Là giống có nguồn gốc từ Trung Quốc, hoa có hai màu, lớp cánh ngoài màu vàng đỏ, nhị màu đen, đƣờng kính hoa từ 13 - 14cm. Cuống hoa dài từ 40 - 45cm, lá hơi tròn, màu xanh đậm, cây sinh trƣởng phát triển trung bình, năng suất hoa 45 - 50 hoa/khóm/năm.
- Giống Yên Hƣng (F160)
Là giống có nguồn gốc từ Trung Quốc. Hoa màu đỏ nhung, có nhiều lớp cánh xếp xít nhau, nhị màu xanh. Cuống hoa dài 50 - 55cm, sinh trƣởng khỏe, năng suất trung bình 50 - 55 hoa/khóm/năm [4].
Ngoài các giống trên, hiện nay còn rất nhiều các giống có nhiều màu sắc khác nhau tạo nên một tập đoàn hoa đồng tiền rất phong phú.
* Nghiên cứu về phương pháp nhân giống.
Theo phƣơng pháp truyền thống ngƣời ta thƣờng nhân giống bằng cách tách chồi từ cây mẹ, phƣơng pháp này vẫn đƣợc áp dụng đến ngày này. Cho đến khi phƣơng pháp nhân giống bằng invitro ra đời ngƣời nông dân đã nhanh chóng tiếp thu các tiến bộ khoa học kĩ thuật này và áp dụng trên
diện rộng trên nhiều loại cây trồng có giá trị kinh tế cao và có hệ số nhân giống cao hơn so với nhân giống bằng phƣơng pháp truyền thống.
Ở nƣớc ta phƣơng pháp nhân giống invitro chỉ mới xuất hiện từ năm 1975, đến nay đã đƣợc áp dụng khá phổ biến và trên nhiều loại cây khác nhau nhƣ dâu tây, khoai tây, hoa lan, hoa cúc, hoa cẩm chƣớng… Trong đó hoa đồng tiền là một trong những loại hoa đƣợc ƣa chuộng và có giá trị kinh tế cao. Hiện nay tại các trung tâm nghiên cứu hoặc những cơ sở nuôi cấy mô nhỏ ở Đà Lạt – Lâm Đồng đã và đang phát triển mạnh mẽ phƣơng pháp nhân giống cây trồng, nhất là những loại cây trồng có giá trị cao. Trong đó đồng tiền cũng là một trong những cây đƣợc ƣu tiên hàng đầu. Tại các nông trại có vốn đầu tƣ của nƣớc ngoài nhƣ Hasfarm, Boniefarm, nông trại tƣ nhân Langbiang Farm và các trung tâm nghiên cứu nhƣ Phân viện sinh học, Trung tâm nghiên cứu khoai tây, rau và hoa đã bƣớc đầu thành công và là nơi cung câp giống hoa đồng tiền invitro.
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Yến, Nguyễn Phúc Huy, Hoàng Văn Cƣơng, Nguyễn Thị Nhật Linh, Nguyễn Bá Nam, Vũ Quốc Luận, Dƣơng Tấn Nhựt về khảo sát ảnh hƣởng của than hoạt tính và nuôi cấy thoáng khí lên khả năng sinh trƣởng và phát triển của cây hoa Đồng tiền invitro và exvitro. Kết quả cho thấy môi trƣờng MS có bổ sung 30 g/l sucrose, 9 g /l agar và 1 g/l than hoạt tính ở điều kiện nuôi cấy thoáng khí là môi trƣờng thích hợp cho sự sinh trƣởng và phát triển cây hoa Đồng tiền. Vị trí của than hoạt tính trong môi trƣờng nuôi cấy ít ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây hoa Đồng tiền invitro. Cây hoa Đồng tiền nuôi cấy thoáng khí trên môi trƣờng MS có bổ sung 1 g/l than hoạt tính khi chuyển ra điều kiện ex vitro có tỉ lệ sống sót rất cao (95 %) [22].
Theo kết quả nghiên cứu chọn tạo và phát triển giống hoa cho Miền Trung của tác giả Đặng Văn Đông và Mai Thị Ngoan đã đƣa ra đƣợc qui trình nhân giống bằng invitro cho đồng tiền giống ĐTH125. Cụ thể: cơ quan nuôi cấy là nụ hoa đồng tiền và đƣợc khử trùng bằng bằng H2O2 40%
trong thời gian 10 phút cho tỷ lệ mẫu sạch đạt 42,9%. Môi trƣờng thích hợp cho sự phát sinh hình thái của mẫu cấy là:MS + 1,5ppmBAP + 0,2 ppmKI + 0,2ppm IAA. Mẫu cấy nụ hoa cho sự phát sinh hình thái đạt 25% số mẫu trong đó 22% số mẫu phát sinh chồi. Môi trƣờng nhân nhanh chồi tốt nhất là: MS+ 0,2mg/l IAA+ 1mg/l Kinetin + 1g (cao nấm men hoặc casein)/l cho hệ số nhân đạt 6 lần. Môi trƣờng hình thành rễ tốt nhất cho chồi hoa đồng invitro là: MS + 0,3 mg/l αNAA. Sau 2 tuần tỷ lệ ra rễ đạt 100%, số rễ đạt 4,2 rễ/chồi, chiều cao cây 5,2cm, cây xanh, mập và khoẻ đủ tiêu chuẩn ra ngôi. Xây dựng qui trình kỹ thuật trồng, chăm sóc, điều khiển nở hoa đồng tiền cho giống ĐTH 125. Thời vụ trồng tháng 2 và tháng 9 hàng năm là tốt nhất. Mật độ trồng là 6 cây/m2 cho cây sinh trƣởng, phát triển tốt, năng suất cao và giảm đƣợc khả năng gây hại của sâu bệnh. Sử dụng phân NPK 20:20:20 + TE và Atonik cho chất lƣợng hoa cao nhất. Dùng chế phẩm Đầu Trâu 902 có hiệu quả hơn so với các chế phẩm khác. Tƣới phân Plan Soult 9:45:15 có hàm lƣợng lân cao trong thời gian cây có nụ. Trồng trong nhà nilon và che 01 lớp lƣới đen là hiệu quả nhất [5].
* Những nghiên cứu về giá thể
Các nhà sinh học tại Viện Nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt đã nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất giá thể tổng hợp trồng hoa Lan và cây cảnh từ các phụ phế phẩm nông nghiệp có ở Lâm Đồng. Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Duy Hạng đã sử dụng các loại phụ phế phẩm nhƣ bã mía, lõi ngô, vỏ đậu phộng, vỏ cà phê… đều có thể tận dụng để sản xuất phân hữu cơ nhờ các chủng vi sinh ƣa nhiệt, có khả năng phân giải các phụ phế phẩm này thành các giá thể để trồng hoa, không chỉ hoa địa Lan mà còn có thể áp dụng cho nhiều loại hoa khác nhau và cây cảnh, thay thế cho các giá thể truyền thống. Nhóm tác giả thiết lập quy trình sản xuất giá thể tổng hợp trồng hoa lan từ các phụ phế phẩm nông nghiệp bằng biện pháp lên men vi sinh. Loại giá thể tổng hợp này đƣợc sản xuất từ các chất hữu cơ có nguồn thực vật, hệ vi sinh vật hiếu khí và các chất khoáng đa lƣợng, trung - vi
lƣợng nên rất thích hợp cho việc nuôi trồng lan và các loại hoa, cây cảnh khác. Dạng giá thể tổng hợp này có thể sản xuất dƣới dạng viên hoặc sợi với thành phần dinh dƣỡng gồm: chất hữu cơ 47%; Nitơ tổng số 0,8%; Phosphor 0,7%; Kali tổng số 1%; Oxid calci 0,3%; Oxid ma-nhê 0,3%; S (lƣu huỳnh) 0,1% và thành phần vi lƣợng nhƣ Zn, Mo, Mn, Cu, B… Ngoài ra, trong giá thể còn có các hợp chất với hoạt tính sinh học cao, giúp cho cây trồng chậu có tính kháng bệnh. Một số hệ vi sinh vật có ích có khả năng ức chế một số loại nấm gây bệnh ở rễ.
Năm 2006, tác giả Huỳnh Thanh Hùng đã nghiên cứu các vật liệu làm giá thể trồng lan Dendrobium tại Thủ Đức ở Thành phố Hồ Chí Minh. Nguyên vật liệu thí nghiệm gồm phân giun đất nguyên chất, than gỗ (làm đối chứng), xơ dừa, mụn xơ dừa, mạt cƣa, rễ lục bình và dớn. Chậu trồng Lan (bằng đất nung) có kích thƣớc 11,5cm x 6,5cm x 8cm. Giá thể đƣợc phối trộn các vật liệu và chất kết dính đƣợc nén chặt tạo thành khối. Sau 5 tháng nghiên cứu theo dõi ảnh hƣởng của giá thể trồng Lan, tác giả có kết luận, trong các vật liệu phối trộn phân bùn với xơ dừa, rễ lục bình và dớn cho cây Lan Dendrobium sinh trƣởng tốt nhất.
Hiện nay, nhiều loại hoa đƣợc nhân giống bằng phƣơng pháp invitro , giai đoạn sau nuôi cấy trong ống nghiệm quyết định tỷ lệ sống và chất lƣợng cây, giá thể giâm đóng vai trò quan trọng. Yêu cầu của giá thể là vừa đảm bảo độ tơi xốp, có khả năng thoát nƣớc tốt, có tính giữ ẩm cao đồng thời phải hoàn toàn sạch các mầm bệnh.
Năm 2006, tác giả Lê Xuân Tảo, đã tiến hành làm thí nghiệm để nghiên cứu loại giá thể thích hợp cho 2 loại hoa trồng chậu là hồng tiểu muội, cúc Indo. Các tác giả đã đƣa ra kết luận, giá thể thích hợp dùng để trồng cúc Indo trong chậu gồm: ¼ trấu hun +1/4 vụn dừa + ¼ phân chuồng giúp cho cây sinh trƣởng phát triển tốt, tỷ lệ nở hoa trên cây và độ bền tự nhiên ngày của cây cao [15].
Sở Nông nghiệp & PTNT Hà Nội (2003), với nghiên cứu bƣớc đầu đã xác định 3 công thức phối trộn giá thể thích hợp cho 3 loại cây hoa nhƣ sau:
+ Hồng Đà Lạt: 76,5% than bùn + 13,5% bèo dâu + 10% đất.
+ Cây cảnh: 76,5% than bùn + 6,75% trấu + 6,75% bèo dâu + 10% đất. + Hoa giống: 45% than bùn + 22,5% trấu + 22,5% bèo dâu + 10% đất.
Năm 2004, các tác giả Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Phƣơng Nga, Nguyễn Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh đã nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây hoa đồng tiền bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào. Nghiên cứu chủ yếu thực hiện trên đối tƣợng là giống hoa đồng tiền hoa kép màu đỏ nhị nâu. Kết quả nghiên cứu cho thấy cơ chất thích hợp để cây con phát triển là trấu hun và mùn với tỷ lệ 1:4 [12].
Năm 2009, tác giả Nguyễn Văn Hồng đã nghiên cứu biện pháp kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào hoa đồng tiền (giống đại tuyết cam) bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tại Thái Nguyên. Kết quả cho thấy giá thể ra cây hoa đồng tiền nuôi cấy mô tốt nhất đối với trong gia đoạn vƣờn ƣơm là giả thể đất, cát, trấu và phân vi sinh Sông Gianh đƣợc trộn theo tỷ lệ 1:1:1:1/4 [7].
* Những nghiên cứu về phân bón và chế độ dinh dưỡng
Dinh dƣỡng là một trong những yếu tố tác động mạnh đến sự sinh trƣởng, phát triển cây trồng nói chung và cây hoa nói riêng. Việc cung cấp dinh dƣỡng hợp lý là biện pháp hữu hiệu để nâng cao năng suất chất lƣợng hoa.
Theo tác giả Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch, Trần Văn Phẩm, (2000), gần đây, trong sản xuất ngƣời ta áp dụng phổ biến phƣơng pháp dƣỡng ngoài rễ chủ yếu là bằng cách phun lên lá. Phƣơng pháp này có những đặc điểm sau:
- Tiết kiệm đƣợc phân. - Tiết kiệm đƣợc nhiên liệu.
- Tiết kiệm đƣợc thời gian và sức lao động.
Thƣờng nên phun vào lúc cây còn non khi màng lớp cutin chƣa thật phát triển, hoặc vào lúc cây sắp đạt cƣờng độ cực đại của quá trình trao đổi [10]. Pomior là một loại phân bón qua lá đƣợc phối hợp nhiều chất dinh dƣỡng đa, trung và vi lƣợng, đƣợc phối hợp với các chất phức hoạt nhằm tăng khả năng bám dính và khả năng thẩm thấu nhanh chất dinh dƣỡng vào trong cây. Tác giả Hoàng Ngọc Thuận đã kết luận, việc bón phân Pomior qua lá cho hoa cúc và các loại hoa trồng chậu là rất cần thiết, làm giảm tỉ lệ rụng nụ, tăng cƣờng quá trình trao đổi chất, hình thành và phát triển nụ rất tốt [21].
Khi nghiên cứu sử dụng chế phẩm phân bón lá nhằm giảm lƣợng phân bón gốc cho hoa Đồng tiền trồng tại Hải Phòng, tác giả Nguyễn Thị Kim Thanh, Phạm Thị Thanh Thuỷ (2008), đã khẳng định: hoa Đồng tiền đƣợc bón bằng phân bón lá có thể giảm lƣợng 1/3 lƣợng phân bón gốc mà không ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng, phát triển và năng suất cũng nhƣ chất lƣợng của hoa Đồng tiền. Các tác giả cũng xác định: trong các chế phẩm nghiên cứu, chế phẩm Pomior và Đầu trâu tỏ ra có hiệu quả hơn đối với cây hoa Đồng tiền so với các loại chế phẩm phân bón lá. Công thức sử dụng chế phẩm Pomior và Đầu Trâu đều có hiệu quả tốt đến các chỉ tiêu sinh trƣởng, phát triển và năng suất [20].
Theo nghiên cứu của Nguyễn Xuân Linh (2005), cây hoa Cúc nếu đƣợc bón đầy đủ và cân đối các loại phân nhƣ phân hữu cơ (phân bắc, phân chuồng, nƣớc giải, phân vi sinh), phân vô cơ và các loại phân vi lƣợng (Cu, Fe, Zn, Mn, Bo, Co) sẽ sinh trƣởng phát triển tốt, cho năng suất và chất lƣợng hoa cao [9].
Theo Nguyễn Quang Thạch (2006), Kỳ Nhân là loại phân bón mới