3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
2.4.Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Nguyên vật liệu dùng cho nghiên cứu Môi trường: Môi trường:
Môi trƣờng thạch: + Thạch SS và EMB
+ Thạch máu (Blood Agar Base)
+ Môi trƣờng Mac Conkey và thạch DHL
Môi trƣờng nƣớc thịt: Nƣớc thịt thƣờng (Nutrient broth), nƣớc thịt BHI (Brain Heart Infusion broth), nƣớc thịt TSB (Tryptone Soya Broth), nƣớc thịt TPB (Tryptone Photphat Broth), …
25
Hóa chất:
- Hóa chất xác định các đặc tính sinh hóa: Oxidase, Catalase, Indol, Urease, ONPG; Các loại đƣờng: Glucose, Lactose, Maltose, Mannitol, Arabinose, Trehalose, Raffinose,…
- Hóa chất sử dụng trong quá trình tách chiết DNA: buffer PBS, buffer CL, buffer BL, buffer BW, buffer AE, Ethanol 96%, Proteinnase K
- Bộ nhuộm Gram, chất chỉ thị màu andrade, thuốc thử oxalat dimetyl paraphenilin diamin, H2O2...
- Cồn, nƣớc cất, nƣớc muối sinh lý...
Dụng cụ:
Que cấy, bơng cồn, ống nghiệm, hộp lồng, bình tam giác, pipet, cân phân tích, bút lơng, ống everdop, ống falcon, đèn cồn v.v.
Thiết bị:
Tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, máy PCR, máy điện di, buồng cấy, nồi hấp vô trùng, máy ly tâm v.v.
2.4.2. Phương pháp thu thập mẫu
- Mẫu phân lập vi khuẩn: dùng tăm bơng vơ trùng ngốy sâu vào trực tràng lợn mắc tiêu chảy chƣa dùng thuốc (kháng sinh) điều trị. Khi tồn bộ tăm bơng thấm ƣớt phân lợn, lấy ra, cho ngay vào tuýp bảo quản, vặn chặt và ghi ký hiệu mẫu. Sau đó, cho vào bảo quản lạnh 2 - 4ºC trong thùng bảo ôn.
- Mẫu chất chứa đếm số lƣợng vi khuẩn: mỗi con lợn lấy 3 - 6 mẫu ở các vị trí khác nhau của ruột, mỗi mẫu là 1 gam chất chứa ở trong ruột lợn ngay khi vừa mổ khám.
- Mẫu bệnh phẩm gồm: máu tim, lách, phân.
- Mẫu đƣợc bảo quản trong điều kiện 4ºC và đƣợc vận chuyển ngay đến phịng thí nghiệm để tiến hành các xét nghiệm tiếp theo.
- Số lƣợng mẫu lấy là 40 mẫu trong đó 15 mẫu phân của lợn con tiêu chảy, 15 mẫu phân của lợn con khỏe mạnh và 10 mẫu phủ tạng.
26
2.4.3. Phương pháp xác định số lượng và giám định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli
2.4.3.1. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn E. coli
Lấy 1g phân pha loãng với 9 ml NaCl 0,9% và rung lắc nhẹ, sau đó pha lỗng đƣợc trong dung dịch PBS thành các nồng độ 10-1, 10-2,....., 10-8. Hút 0,1 ml dung dịch đã pha loãng ở nồng độ 10–6, 10–7 và 10-8 vào đĩa thạch EMB đã chuẩn bị trƣớc, mỗi nồng độ sử dụng 3 đĩa thạch. Sử dụng phƣơng pháp cấy láng trên thạch. Sau khi cấy láng, để trong tủ ấm 370C/24h, đếm những khuẩn lạc E. coli điển hình màu tím đen có ánh kim loại màu xanh lá cây.
Số lƣợng vi khuẩn đƣợc tính theo cơng thức: X = 10 × a × b
Trong đó:
X là tổng số lƣợng vi khuẩn có trong 1g phân hoặc chất chứa. a là số lƣợng vi khuẩn trung bình của 1 nồng độ pha lỗng. b là hệ số pha loãng mẫu.
Hệ số 10: vì cấy 0,1 ml.
Biểu thị kết quả dƣới dạng thập phân, làm trịn số kết quả có đƣợc, chỉ giữ lại hai số có nghĩa
2.4.3.2. Phương pháp giám định đặc tính sinh hóa vi khuẩn E .coli
*Phản ứng lên men đường
- Chuẩn bị mơi trƣờng BHI: pha lỗng theo cơng thức có sẵn. - Chỉ thị mầu bromothymol blue pha theo tỷ lệ:
Cồn 900: 100 ml và Bromothymol blue: 1,5g
- Lấy 100ml BHI cho vào 0,6 ml chỉ thị Bromothymol blue lắc đều, phân vào các ống nghiệm ở đáy đã có một ống Durham. Hấp ƣớt ở 1200C trong 30 phút. Môi trƣờng mầu xanh lơ.
- Pha các loại đƣờng : Mantose, Manitol, Sorbitol, Sucrose, Inulin, Glucose, Xylose, Salicin, Lactose, Galactose, Arabinose thành dung dịch 10%, hấp cách quãng trong 30 phút mỗi ngày, hấp trong 3 ngày.
27
- Mỗi ống môi trƣờng cho một loại đƣờng theo tỷ lệ 0,3ml dung dịch đƣờng 10%. Trong 4ml môi trƣờng.
- Từ đó cấy vi khuẩn E. coli cần kiểm tra vào ống BHI có chứa đƣờng rồi để trong tủ ấm 370
C trong 24h.
* Kết quả
Phản ứng lên men đường
+ Dƣơng tính : mơi trƣờng chuyển vàng + Âm tính: mơi trƣờng khơng chuyển màu
Phản ứng sinh hơi
+ Phản ứng dƣơng tính: ống Durham bị đẩy lên, trong ống có một khoảng khơng khí.
+ Phản ứng âm tính: ống Durham vẫn ở đáy ống nghiệm, trong ống nghiệm khơng có gì.
* VP
- Cấy vi khuẩn nghi ngờ vào môi trƣờng pepton glucose, nuôi ở 37oC. Sau 24 giờ nhỏ vào môi trƣờng nuôi cấy trên 5 giọt thuốc thử VP, đọc kết quả sau 5 phút đến 120 phút.
- Phản ứng dƣơng tính: mơi trƣờng xuất hiện màu đỏ hồng. - Phản ứng âm tính: mơi trƣờng khơng biến màu hoặc màu vàng.
* MR
- Cấy vi khuẩn vào môi trƣờng pepton glucose, nuôi ở 37oC, sau 24 giờ nhỏ vào môi trƣờng nuôi cấy trên 5 giọt dung dịch đỏ methyl trong cồn 95o, đọc kết quả sau 5 phút.
- Phản ứng dƣơng tính: mơi trƣờng màu đỏ - Phản ứng âm tính: mơi trƣờng màu vàng.
- Phản ứng nghi ngờ: mơi trƣờng có màu giữa đỏ và vàng. * Citrat
- Phản ứng kiểm tra sự sử dụng Citrat của vi khuẩn.
- Cấy vi khuẩn vào thạch Simon Citrat nuôi ở 37oC từ 18 giờ đến 24 giờ. - Phản ứng dƣơng tính: mơi trƣờng chuyển từ màu xanh lá cây sang màu
28 xanh nƣớc biển.
- Phản ứng âm tính: mơi trƣờng giữ nguyên màu xanh lá cây.
* Sinh H2S
- Cấy vi khuẩn vào môi trƣờng TSI, để tủ ấm 37oC, sau 24h lấy ra đọc kết quả. - Phản ứng dƣơng tính: phần thạch đứng xuất hiện màu đen.
- Phản ứng âm tính: phần thạch đứng khơng xuất hiện màu đen.
2.4.4. Phương pháp xác định số lượng và giám định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella
2.4.4.1. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn Salmonella
Lấy 1g phân pha loãng với 9 ml NaCl 0,9% và rung lắc nhẹ, sau đó pha lỗng thành các nồng độ 10-1, 10-2,....., 10-8. Hút 0,1 ml dung dịch đã pha loãng ở nồng độ 10–6, 10–7 và 10-8 vào đĩa thạch DHL đã chuẩn bị trƣớc, mỗi nồng độ sử dụng ba đĩa thạch. Sử dụng phƣơng pháp cấy láng trên thạch. Sau khi cấy láng, để trong tủ ấm 370C/24h, đếm những khuẩn lạc Salmonella có hình thái trịn trơn dạng S, dìa gọn, ở giữa màu đen xung quanh trắng trong.
Tính kết quả: số lƣợng vi khuẩn đƣợc tính theo cơng thức: X = 10 × a × b
Trong đó:
X là tổng số lƣợng vi khuẩn có trong 1g phân hoặc chất chứa. a là số lƣợng vi khuẩn trung bình của 1 nồng độ pha lỗng. b là hệ số pha lỗng mẫu.
Hệ số10: vì cấy 0,1 ml.
Biểu thị kết quả dƣới dạng thập phân, làm trịn số kết quả có đƣợc, chỉ giữ lại hai số có nghĩa.
2.4.4.2. Phương pháp giám định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Salmonella
Từ mơi trƣờng DHL, chọn ra các khuẩn lạc Salmonella điển hình cấy vào môi trƣờng nƣớc thịt để kiểm tra một số đặc tính sinh hóa.
29
a. Chuẩn bị mơi trƣờng
+ Môi trƣờng dùng để kiểm tra phản ứng lên men đƣờng là mơi trƣờng nƣớc pepton có chứa đƣờng:
Pepton bột 10 g NaCl 5 g Nƣớc cất 1000 ml Sau đó chỉnh pH về 7,4.
+ Đối với môi trƣờng pepton đã có chứa sẵn chỉ thị mầu phenolred thì pha theo hƣớng dẫn trên bao bì.
Pha chỉ thị mầu andrade
Fucsin axit 0,5 g
Nƣớc cất 100 ml
Dung dịch NaOH - 1N 16 ml
Nghiền Fucsin trong cối sứ cho nhỏ mịn rồi hòa nƣớc cất vào cho tan hết. Cho từ từ dung dịch NaOH – 1N, vừa cho vừa lắc đến khi nào mầu chuyển thành mầu nâu vàng thì thơi. Để lắng 1 – 2 giờ rồi lọc qua giấy lọc.
Khi dùng lấy 1 ml chỉ thị mầu andrade cho vào 100 ml mơi trƣờng nƣớc thịt pepton có đƣờng. Sau đó chia đều 8 ml/ ống nghiệm có ống duhan sao cho mơi trƣờng đi vào đầy ống Duhan và tuyệt đối khơng để bọt khí trong ống.Tiếp theo hấp vô trùng ở 1200C trong 30 phút.
Pha chỉ thị mầu phenolred
Chúng ta đã và đang sử dụng loại mơi trƣờng tổng hợp có sẵn chỉ thị mầu nên chỉ việc pha theo hƣớng dẫn: 15 g/ 1 lít, sau đó chỉnh pH về 7,4. Sau đó hấp ở 1180
C trong 15 phút.
30
Pha các loại đƣờng : Glucose, Lactose, Manitol, Mantol, Salicin, Trehalose, Rhamnose, Arabinose, Sobitol, Sucrose, Cellbinose thành dung dịch đƣờng 20%. Pha xong đem hấp ở 1100
C trong 20 - 30 phút.
c. Chuẩn bị canh trùng
Môi trƣờng lỏng nuôi cấy Salmonella là Tryptone Phosphate Broth ( TPB). Pha theo dẫn trên nhãn, có thể chia vào ống nắp vặn sau đó hấp ƣớt ở 1210C trong 15 phút. Sau 24h môi trƣờng đảm bảo vô trùng, tức là theo dõi sau khi hấp 24h môi trƣờng không bị đục ta tiến hành vét giống nghi là Salmonella trên
thạch DHL vào ống nghiệm có sẵn mơi trƣờng để ni trong tủ ấm 370C trong vòng 24h.
d. Tiến hành phản ứng
B1: Kiểm tra vô trùng đƣờng: Cho vào mỗi ống môi trƣờng 1 loại đƣờng theo
tỉ lệ là 0,3 ml dung dịch đƣờng 20%.
B2: Hút 0,3 ml giống vi khuẩn cần chẩn đoán vào những ống môi trƣờng trên
rồi để trong tủ ấm 370C trong 24h lấy ra đọc kết quả.
e. Cách đọc kết quả
Đối với chất chỉ thị mầu andrade
Nếu vi khuẩn không sinh axit thì mơi trƣờng khơng đổi mầu, mầu vẫn nâu vàng. Nếu vi khuẩn sinh axit thì màu chuyển thành màu hồng cánh sen.
Nếu vi khuẩn sinh hơi thì thấy bọt khí trong ống Duhan và mực nƣớc trong ống Duhan bị tụt xuống.
Đối với chất chỉ thị mầu phenolred
- Nếu vi khuẩn khơng sinh axit thì mơi trƣờng khơng đổi mầu, mầu vẫn hồng cam. Nếu vi khuẩn sinh axit thì màu chuyển thành màu vàng.
- Nếu vi khuẩn sinh hơi thì thấy bọt khí trong ống Duhan và mực nƣớc trong ống Duhan bị tụt xuống.
Phản ứng thử Oxydaza
31
- Phƣơng pháp thử: Nhỏ 1 giọt thuốc thử ra giâý thấm vơ trùng, sau đó dùng que cấy bạch kim lâý khuẩn lạc của vi khuẩn cần thử di trên giấy đã thấm thuốc thử. Sau 10 giây nếu phản ứng dƣơng tính thì miếng giấy thấm sẽ xuất hiện lên màu tím, nếu âm tính thì màu sắc khơng đổi.
Phản ứng thử Catalaza
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ mơi trƣờng thạch đĩa, cho lên phiến kính sạch, sau đó nhỏ 1-2 giọt dung dịch 3 % H2O2 vào đó, nếu có sủi bọt là phản ứng dƣơng tính.
2.4.5. Phương pháp xác định Salmonella và E. coli bằng kỹ thuật PCR
2.4.5.1. Kỹ thuật tách DNA vi khuẩn gram âm Các bước tiến hành:
Pha 48mg Proteinase K dạng đông khô trong 2,4ml đệm tƣơng ứng (PK Storage buffer) đạt nồng độ 20mg/ml.
Trộn đều bằng máy vortex, sau đó chia đều ra các ống eppendorf, bảo quản ở tủ -20ºC.
Bước 1: Thu tế bào
Đối với TB nuôi trên đĩa thạch: Thu khoảng 1 vòng que cấy tế bào trên đĩa thạch cho vào ống eppendorf 1.5ml. Bổ sung 500ul đệm PBS vô trùng, trộn đều bằng máy vortex. Ly tâm 6000 vòng, 5 phút => bỏ dịch, giữ lại tủa tế bào.
Đối với tế bào nuôi lắc: Ly tâm thu tủa tế bào, loại bỏ dịch. (A600 = 1 sẽ tƣơng đƣơng khoảng 2x109 tế bào).
Bước 2: Thêm đệm CL
Bổ sung 200µL đệm CL vào tế bào thu đƣợc trong ống eppendorf 1,5ml. Trộn đều bằng pipet.
Bước 3: Xử lý enzyme
Bổ sung 20 µL Proteinase K (20mg/ml). Trộn đều bằng máy votex. Ủ ở 56ºC trong 15 phút cho đến khi dung dịch trong suốt (Thời gian ủ có thể thay
32
đổi tùy theo loại vi khuẩn và số lƣợng tế bào. Có thể ủ lâu hơn để phân giải hoàn toàn tế bào).
Sau khi ủ đƣa hỗn hợp về nhiệt độ phòng.
Spin để dồn hết chất lỏng xuống không để đọng trên nắp.
Bước 4: Xử lý loại RNA (có thể khơng cần thiết)
Khi thí nghiệm u cầu khơng lẫn tạp RNA vào hỗn hợp DNA, xử lý mẫu tách bằng 20µl RNAse.
Trộn đều bằng máy vortex và ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 5: Thêm đệm BL
Bổ sung 200 µl Buffer BL và trộn đều bằng máy vortex. Ủ ở 70ºC trong vòng 10 phút.
Đƣa về nhiệt độ phòng và spin để dồn chất lỏng xuống.
Bƣớc này là bƣớc quan trọng, phải trộn đều mẫu và đệm BL để cho kết quả tốt nhất.
Bước 6: Thêm Ethanol
Bổ sung 200µl Cồn ethanol 96% (khơng kèm trong kit) Trộn đều bằng máy vortex, Spin để dồn chất lỏng xuống
Chú ý trộn đều mẫu và ethanol để cho kết quả tốt. Sau khi bổ sung ethanol vào mẫu sẽ xuất hiện kết tủa trắng. Bƣớc này cần thiết để chuyển tất cả hỗn hợp, kể cả kết tủa sang cột SV ở bƣớc tiếp theo.
Bước 7: Chuyển lên cột
Chuyển toàn bộ chất lỏng lên Cột SV bằng pipet một cách cẩn thận. Ly tâm 13000 vòng trong 1 phút.
Chuyển cột sang đế mới.
Nếu hỗn hợp khơng chảy hết qua màng thì tiến hành ly tâm lại ở tốc độ tối đa cho đến khi loại bỏ hết tất cả phần dung dịch. Ly tâm ở tốc độ tối đa không ảnh hƣởng đến việc thu DNA.
Bước 8: Thêm đệm BW
Bổ sung 600 µl đệm BW và ly tâm ở 13000 vòng trong 1 phút. Loại bỏ chất lỏng ở đế cột, giữ lại cột.
33
Nếu cột SV có cặn mầu sau khi ly tâm thì lặp lại bƣớc này cho đến khi loại bỏ đƣợc cặn mầu.Xem phần hƣớng dẫn xử lý sự cố trong thí nghiệm.
Ly tâm ở tốc độ tối đa khơng ảnh hƣởng đến việc thu DNA.
Bước 9: Thêm đệm TW
Bổ sung 700 µl Buffer TW và ly tâm ở 13000 vòng trong 1 phút. Loại bỏ chất lỏng ở đế cột, giữ lại cột.
Bước 10: Ly tâm
Ly tâm 10 phút ở 13000 vòng, bỏ đế cột. Chuyển cột sang ống eppendorf 1,5ml mới
Bƣớc này cần thực hiện cẩn thận để loại bỏ hết chất mang của đệm TW. Nếu vẫn còn chất mang của đệm TW thì lặp lại bƣớc này rồi mới chuyển cột sang ống eppendorf 1.5ml mới.
Ly tâm phải thực hiện ở tốc độ tối đa.
Bước 11: Thu DNA
Bổ sung 50µl đệm AE hoặc nƣớc. Để yên trong vòng 1 phút ở nhiệt độ phòng.
Ly tâm ở 13000 vịng trong 1 phút.
Chú ý: Các hóa chất sử dụng trong quá trình tách chiết:
+ PBS buffer (Phosphate Buffered Saline): Là một dung dịch đệm đƣợc dùng phổ biến trong nghiên cứu sinh học, không độc với hầu hết các tế bào, giữ ổn định độ pH của môi trƣờng.
+ Proteinase K: Là một serin protease phổ rộng, có tác dụng thủy phân Protein. Enzym này đƣợc chiết xuất từ nấm Engyodontium album. Proteinase K có thể tiêu hóa đƣợc keratin tự nhiên (tóc), do đó nó có tên là Proteinase K.
+ Buffer CL: (Cell Lysis buffer): Trong hầu hết các quy trình tách chiết đối với nucleic acid, protein hay các nội quan khác thì bƣớc đầu tiên ln ln là ly giải tế bào. Lysis buffer là một dung dịch đệm đƣợc dùng để phá vỡ cấu trúc màng tế bào và hầu hết chứa các muối để điều chỉnh độ axít và độ thẩm thấu của tế bào ly giải.
34
+ Buffer BL (Bacterial Lysis buffer): Trong tách chiết DNA, đệm này đƣợc sử dụng để hòa tan DNA cũng nhƣ RNA, do đó nó sẽ ngăn chặn q trình thủy phân của DNA.
+ Ethanol (96%): Kết tủa DNA trong dung dịch.
+ Buffer BW (Bind and Wash buffer): Loại bỏ các muối và các thành phần khác của quá trình tách chiết, chỉ giữ lại DNA trên cột.
+ Buffer AE: (Acetate-EDTA buffer): Là một buffer để lƣu trữ DNA, giảm thiểu quá trình thủy phân của DNA trong khi thao tác các thí nghiệm.
2.4.5.2. Kỹ thuật PCR xác định Salmonella và E. coli
PCR (Polymerase Chain Reaction) còn đƣợc gọi là phản ứng khuếch đại đoạn gen, đây là phƣơng pháp tổng hợp một đoạn DNA đặc hiệu trong điều kiện in-vitro với sự xúc tác của enzyme DNA-Polymerase để cắt 1 đoạn DNA đích cần tổng hợp. Cho đến nay kỹ thuật PCR đƣợc xem là một trong những phƣơng pháp nền quan trọng nhất của công nghệ sinh học hiện đại.
2.4.5.3. Kỹ thuật PCR được sử dụng để xác định gen Stn a. Thành phần phản ứng PCR (từ khuẩn lạc)