3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
1.3.Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc
Tiêu chảy là một loại bệnh rất hay gặp trong chăn nuôi đặc biệt là ngành chăn nuôi lợn. Bệnh xảy ra thƣờng xuyên với đặc điểm dịch tễ hết sức phức tạp, đã và đang gây nên những thiệt hại to lớn, làm giảm năng xuất và chất lƣợng sản phẩm vật nuôi gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi, làm giảm tăng trọng và lợn con dễ bị suy kiệt, chết.
1.3.1. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài
Tiêu chảy ở lợn con là căn bệnh phổ biến trên khắp thế giới, gây thiệt hại thƣờng xuyên với tất cả các cơ sở chăn nuôi tập trung theo mọi phƣơng thức truyền thống và cơng nghiệp, thậm chí ngay cả điều kiện chăn ni sạch (Plonait.H, Bickhardt. K, 1997). Vi khuẩn E. coli lần đầu tiên đƣợc Theobald Escherich phát hiện vào năm 1885 và đƣợc coi là một vi khuẩn vô hại sống trong ruột già ngƣời và động vật. Đến năm 1955, Schofield và Davis mới chứng minh đƣợc vai trò gây bệnh đƣờng ruột của E. coli ở lợn con.
Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung có rất nhiều nguyên nhân gây ra hội chứng tiêu chảy mà ngƣời chăn nuôi cần chú ý. Nhắc tới nguyên nhân gây ra hội chứng này chúng ta không thể khơng quan tâm tới vai trị của hai loại vi khuẩn E. coli và Salmonella. Để giải quyết vấn đề này đã có nhiều nhà khoa học trên thế giới đi sâu nghiên cứu về vấn đề này.
Theo purvis G.M và cộng sự (1985) cho rằng phƣơng thức cho ăn không phù hợp là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy ở lợn con.
Niconxki V.V (1971) đã nhấn mạnh khi cơ thể gia súc non bị lạnh kéo dài sẽ làm giảm phản ứng miễn dịch làm giảm số lƣợng bạch cầu và tác dụng thực bào, giảm khả năng diệt trùng của máu do đó gia súc dễ bị vi khuẩn tấn cơng.
22
Năm (1972) Mouwen đã kết luận niêm mạc ruột non của lợn có sự biến đổi lớn trong trƣờng hợp lợn con ỉa phân trắng do Rotavirut.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Trong những năm gần đây, thực hiện mục tiêu Cơng nghiệp hóa - Hiện đại hóa nơng nghiệp nhà nƣớc đã tập trung chuyển dịch mạnh mẽ cơ cấu trong nơng nghiệp. Ngành chăn ni từng bƣớc đã có sự đầu tƣ về khoa học kỹ thuật, vốn, đƣa giống mới có giá trị kinh tế cao vào sản xuất góp phần làm thay đổi bộ mặt kinh tế nông thôn. Bên cạnh những thuận lợi thì nhà nƣớc ta còn gặp rất nhiều khó khăn trong cơng tác phịng chống dịch bệnh. Dịch bệnh là một điều đáng lo cho ngƣời dân trong chăn nuôi đặc biệt là bệnh phân trắng ở lợn con dƣới 60 ngày tuổi. Bệnh phân trắng ở lợn con nƣớc ta đã đƣợc nghiên cứu từ năm 1959 tại các cơ sở chăn nuôi tập trung (trại chăn nuôi và các nông trƣờng quốc doanh).
Năm 1993, Lê Văn Tạo và cs đã nghiên cứu các yếu tố gây bệnh của chủng E. coli gây bệnh, chọn chủng E. coli để chế tạo vacxin chết dƣới dạng cho uống. Vacxin dùng cho lợn con sau đẻ 2 giờ phải uống với liều 1ml/con, liên tục trong 3 - 5 ngày. Kết quả làm giảm tỉ lệ mắc bệnh phân trắng lợn con từ 30 - 35 % so với đối chứng.
Lý Thị Liên Khai (2001), đã phân lập và xác định độc tố ruột ở các chủng
E. coli gây bệnh tiêu chảy ở lợn con. Tác giả cho rằng các chủng K88 sinh độc
ruột LT và ST : K99 và 987p sinh độc tố ruột ST, độc tố ruột ST trở nên rất độc khi có sức đề kháng của vật chủ giảm, gây tiêu chảy cho lợn con đang bú mẹ, phổ biến ở 1 - 2 tuần tuổi.
Phan Thanh Phƣợng và cs (2008), đã nghiên cứu đƣa kháng thể E. coli
dạng bột từ lòng đỏ trứng gà đã đƣợc miễn dịch các chủng K88, K99, 987p vào phòng bệnh cho lợn.
Phan Thanh Phƣợng và cs (2008), đã nghiên cứu, khảo sát và đƣa vào ứng dụng theo khu vực 2 loại kháng thể dạng bột và dạng đơng khơ phịng trị bệnh
23
E. coli và tụ huyết trùng lợn.
Các nghiên cứu trên đã cho thấy mức độ, vai trò gây bệnh của hai loại vi khuẩn. Kết quả nghiên cứu đã góp phần đƣa ra một số giải pháp cần thiết cũng nhƣ các giải pháp tối ƣu nhằm giảm thiểu bệnh tiêu chảy ở đàn lợn.
24
CHƢƠNG 2
ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Vi khuẩn E. coli và Salmonella phân lập đƣợc từ mẫu phân lợn nuôi tại
khu chăn nuôi của công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
2.2.1. Địa điểm nghiên cứu
Tại phịng thí nghiệm của cơng ty cổ phần thuốc thú y Marphavet
2.2.2. Thời gian nghiên cứu
Đề tài thực hiện từ tháng 10 năm 2017 đến tháng 3 năm 2018.
2.3. Nội dung nghiên cứu
Phân lập, xác định số lƣợng vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. từ phân lợn con khỏe và phân lợn con tiêu chảy tại khu chăn nuôi của công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet.
Kiểm tra một số đặc tính ni cấy của vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. phân lập đƣợc.
Giám định một số đặc tính sinh hố của vi khuẩn E. coli và Salmonella spp. phân lập đƣợc.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.4.1. Nguyên vật liệu dùng cho nghiên cứu Môi trường: Môi trường:
Môi trƣờng thạch: + Thạch SS và EMB
+ Thạch máu (Blood Agar Base)
+ Môi trƣờng Mac Conkey và thạch DHL
Môi trƣờng nƣớc thịt: Nƣớc thịt thƣờng (Nutrient broth), nƣớc thịt BHI (Brain Heart Infusion broth), nƣớc thịt TSB (Tryptone Soya Broth), nƣớc thịt TPB (Tryptone Photphat Broth), …
25
Hóa chất:
- Hóa chất xác định các đặc tính sinh hóa: Oxidase, Catalase, Indol, Urease, ONPG; Các loại đƣờng: Glucose, Lactose, Maltose, Mannitol, Arabinose, Trehalose, Raffinose,…
- Hóa chất sử dụng trong quá trình tách chiết DNA: buffer PBS, buffer CL, buffer BL, buffer BW, buffer AE, Ethanol 96%, Proteinnase K
- Bộ nhuộm Gram, chất chỉ thị màu andrade, thuốc thử oxalat dimetyl paraphenilin diamin, H2O2...
- Cồn, nƣớc cất, nƣớc muối sinh lý...
Dụng cụ:
Que cấy, bơng cồn, ống nghiệm, hộp lồng, bình tam giác, pipet, cân phân tích, bút lơng, ống everdop, ống falcon, đèn cồn v.v.
Thiết bị:
Tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, máy PCR, máy điện di, buồng cấy, nồi hấp vô trùng, máy ly tâm v.v.
2.4.2. Phương pháp thu thập mẫu
- Mẫu phân lập vi khuẩn: dùng tăm bơng vơ trùng ngốy sâu vào trực tràng lợn mắc tiêu chảy chƣa dùng thuốc (kháng sinh) điều trị. Khi tồn bộ tăm bơng thấm ƣớt phân lợn, lấy ra, cho ngay vào tuýp bảo quản, vặn chặt và ghi ký hiệu mẫu. Sau đó, cho vào bảo quản lạnh 2 - 4ºC trong thùng bảo ôn.
- Mẫu chất chứa đếm số lƣợng vi khuẩn: mỗi con lợn lấy 3 - 6 mẫu ở các vị trí khác nhau của ruột, mỗi mẫu là 1 gam chất chứa ở trong ruột lợn ngay khi vừa mổ khám.
- Mẫu bệnh phẩm gồm: máu tim, lách, phân.
- Mẫu đƣợc bảo quản trong điều kiện 4ºC và đƣợc vận chuyển ngay đến phịng thí nghiệm để tiến hành các xét nghiệm tiếp theo.
- Số lƣợng mẫu lấy là 40 mẫu trong đó 15 mẫu phân của lợn con tiêu chảy, 15 mẫu phân của lợn con khỏe mạnh và 10 mẫu phủ tạng.
26
2.4.3. Phương pháp xác định số lượng và giám định một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn E. coli
2.4.3.1. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn E. coli
Lấy 1g phân pha loãng với 9 ml NaCl 0,9% và rung lắc nhẹ, sau đó pha lỗng đƣợc trong dung dịch PBS thành các nồng độ 10-1, 10-2,....., 10-8. Hút 0,1 ml dung dịch đã pha loãng ở nồng độ 10–6, 10–7 và 10-8 vào đĩa thạch EMB đã chuẩn bị trƣớc, mỗi nồng độ sử dụng 3 đĩa thạch. Sử dụng phƣơng pháp cấy láng trên thạch. Sau khi cấy láng, để trong tủ ấm 370C/24h, đếm những khuẩn lạc E. coli điển hình màu tím đen có ánh kim loại màu xanh lá cây.
Số lƣợng vi khuẩn đƣợc tính theo cơng thức: X = 10 × a × b
Trong đó:
X là tổng số lƣợng vi khuẩn có trong 1g phân hoặc chất chứa. a là số lƣợng vi khuẩn trung bình của 1 nồng độ pha loãng. b là hệ số pha lỗng mẫu.
Hệ số 10: vì cấy 0,1 ml.
Biểu thị kết quả dƣới dạng thập phân, làm trịn số kết quả có đƣợc, chỉ giữ lại hai số có nghĩa
2.4.3.2. Phương pháp giám định đặc tính sinh hóa vi khuẩn E .coli
*Phản ứng lên men đường
- Chuẩn bị mơi trƣờng BHI: pha lỗng theo cơng thức có sẵn. - Chỉ thị mầu bromothymol blue pha theo tỷ lệ:
Cồn 900: 100 ml và Bromothymol blue: 1,5g
- Lấy 100ml BHI cho vào 0,6 ml chỉ thị Bromothymol blue lắc đều, phân vào các ống nghiệm ở đáy đã có một ống Durham. Hấp ƣớt ở 1200C trong 30 phút. Môi trƣờng mầu xanh lơ.
- Pha các loại đƣờng : Mantose, Manitol, Sorbitol, Sucrose, Inulin, Glucose, Xylose, Salicin, Lactose, Galactose, Arabinose thành dung dịch 10%, hấp cách quãng trong 30 phút mỗi ngày, hấp trong 3 ngày.
27
- Mỗi ống môi trƣờng cho một loại đƣờng theo tỷ lệ 0,3ml dung dịch đƣờng 10%. Trong 4ml mơi trƣờng.
- Từ đó cấy vi khuẩn E. coli cần kiểm tra vào ống BHI có chứa đƣờng rồi để trong tủ ấm 370
C trong 24h.
* Kết quả
Phản ứng lên men đường
+ Dƣơng tính : mơi trƣờng chuyển vàng + Âm tính: mơi trƣờng khơng chuyển màu
Phản ứng sinh hơi
+ Phản ứng dƣơng tính: ống Durham bị đẩy lên, trong ống có một khoảng khơng khí.
+ Phản ứng âm tính: ống Durham vẫn ở đáy ống nghiệm, trong ống nghiệm khơng có gì.
* VP
- Cấy vi khuẩn nghi ngờ vào môi trƣờng pepton glucose, nuôi ở 37oC. Sau 24 giờ nhỏ vào môi trƣờng nuôi cấy trên 5 giọt thuốc thử VP, đọc kết quả sau 5 phút đến 120 phút.
- Phản ứng dƣơng tính: mơi trƣờng xuất hiện màu đỏ hồng. - Phản ứng âm tính: mơi trƣờng khơng biến màu hoặc màu vàng.
* MR
- Cấy vi khuẩn vào môi trƣờng pepton glucose, nuôi ở 37oC, sau 24 giờ nhỏ vào môi trƣờng nuôi cấy trên 5 giọt dung dịch đỏ methyl trong cồn 95o, đọc kết quả sau 5 phút.
- Phản ứng dƣơng tính: mơi trƣờng màu đỏ - Phản ứng âm tính: mơi trƣờng màu vàng.
- Phản ứng nghi ngờ: mơi trƣờng có màu giữa đỏ và vàng. * Citrat
- Phản ứng kiểm tra sự sử dụng Citrat của vi khuẩn.
- Cấy vi khuẩn vào thạch Simon Citrat nuôi ở 37oC từ 18 giờ đến 24 giờ. - Phản ứng dƣơng tính: mơi trƣờng chuyển từ màu xanh lá cây sang màu
28 xanh nƣớc biển.
- Phản ứng âm tính: mơi trƣờng giữ nguyên màu xanh lá cây.
* Sinh H2S
- Cấy vi khuẩn vào môi trƣờng TSI, để tủ ấm 37oC, sau 24h lấy ra đọc kết quả. - Phản ứng dƣơng tính: phần thạch đứng xuất hiện màu đen.
- Phản ứng âm tính: phần thạch đứng khơng xuất hiện màu đen.
2.4.4. Phương pháp xác định số lượng và giám định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella
2.4.4.1. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn Salmonella
Lấy 1g phân pha loãng với 9 ml NaCl 0,9% và rung lắc nhẹ, sau đó pha lỗng thành các nồng độ 10-1, 10-2,....., 10-8. Hút 0,1 ml dung dịch đã pha loãng ở nồng độ 10–6, 10–7 và 10-8 vào đĩa thạch DHL đã chuẩn bị trƣớc, mỗi nồng độ sử dụng ba đĩa thạch. Sử dụng phƣơng pháp cấy láng trên thạch. Sau khi cấy láng, để trong tủ ấm 370C/24h, đếm những khuẩn lạc Salmonella có hình thái trịn trơn dạng S, dìa gọn, ở giữa màu đen xung quanh trắng trong.
Tính kết quả: số lƣợng vi khuẩn đƣợc tính theo cơng thức: X = 10 × a × b
Trong đó:
X là tổng số lƣợng vi khuẩn có trong 1g phân hoặc chất chứa. a là số lƣợng vi khuẩn trung bình của 1 nồng độ pha lỗng. b là hệ số pha lỗng mẫu.
Hệ số10: vì cấy 0,1 ml.
Biểu thị kết quả dƣới dạng thập phân, làm tròn số kết quả có đƣợc, chỉ giữ lại hai số có nghĩa.
2.4.4.2. Phương pháp giám định đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Salmonella
Từ môi trƣờng DHL, chọn ra các khuẩn lạc Salmonella điển hình cấy vào mơi trƣờng nƣớc thịt để kiểm tra một số đặc tính sinh hóa.
29
a. Chuẩn bị môi trƣờng
+ Môi trƣờng dùng để kiểm tra phản ứng lên men đƣờng là môi trƣờng nƣớc pepton có chứa đƣờng:
Pepton bột 10 g NaCl 5 g Nƣớc cất 1000 ml Sau đó chỉnh pH về 7,4.
+ Đối với môi trƣờng pepton đã có chứa sẵn chỉ thị mầu phenolred thì pha theo hƣớng dẫn trên bao bì.
Pha chỉ thị mầu andrade
Fucsin axit 0,5 g
Nƣớc cất 100 ml
Dung dịch NaOH - 1N 16 ml
Nghiền Fucsin trong cối sứ cho nhỏ mịn rồi hòa nƣớc cất vào cho tan hết. Cho từ từ dung dịch NaOH – 1N, vừa cho vừa lắc đến khi nào mầu chuyển thành mầu nâu vàng thì thơi. Để lắng 1 – 2 giờ rồi lọc qua giấy lọc.
Khi dùng lấy 1 ml chỉ thị mầu andrade cho vào 100 ml môi trƣờng nƣớc thịt pepton có đƣờng. Sau đó chia đều 8 ml/ ống nghiệm có ống duhan sao cho mơi trƣờng đi vào đầy ống Duhan và tuyệt đối khơng để bọt khí trong ống.Tiếp theo hấp vơ trùng ở 1200C trong 30 phút.
Pha chỉ thị mầu phenolred
Chúng ta đã và đang sử dụng loại môi trƣờng tổng hợp có sẵn chỉ thị mầu nên chỉ việc pha theo hƣớng dẫn: 15 g/ 1 lít, sau đó chỉnh pH về 7,4. Sau đó hấp ở 1180
C trong 15 phút.
30
Pha các loại đƣờng : Glucose, Lactose, Manitol, Mantol, Salicin, Trehalose, Rhamnose, Arabinose, Sobitol, Sucrose, Cellbinose thành dung dịch đƣờng 20%. Pha xong đem hấp ở 1100
C trong 20 - 30 phút.
c. Chuẩn bị canh trùng
Môi trƣờng lỏng nuôi cấy Salmonella là Tryptone Phosphate Broth ( TPB). Pha theo dẫn trên nhãn, có thể chia vào ống nắp vặn sau đó hấp ƣớt ở 1210C trong 15 phút. Sau 24h môi trƣờng đảm bảo vô trùng, tức là theo dõi sau khi hấp 24h môi trƣờng không bị đục ta tiến hành vét giống nghi là Salmonella trên
thạch DHL vào ống nghiệm có sẵn mơi trƣờng để ni trong tủ ấm 370C trong vịng 24h.
d. Tiến hành phản ứng
B1: Kiểm tra vô trùng đƣờng: Cho vào mỗi ống môi trƣờng 1 loại đƣờng theo
tỉ lệ là 0,3 ml dung dịch đƣờng 20%.
B2: Hút 0,3 ml giống vi khuẩn cần chẩn đốn vào những ống mơi trƣờng trên
rồi để trong tủ ấm 370C trong 24h lấy ra đọc kết quả.
e. Cách đọc kết quả
Đối với chất chỉ thị mầu andrade
Nếu vi khuẩn khơng sinh axit thì mơi trƣờng khơng đổi mầu, mầu vẫn nâu vàng. Nếu vi khuẩn sinh axit thì màu chuyển thành màu hồng cánh sen.
Nếu vi khuẩn sinh hơi thì thấy bọt khí trong ống Duhan và mực nƣớc trong ống Duhan bị tụt xuống.
Đối với chất chỉ thị mầu phenolred
- Nếu vi khuẩn khơng sinh axit thì mơi trƣờng khơng đổi mầu, mầu vẫn hồng cam. Nếu vi khuẩn sinh axit thì màu chuyển thành màu vàng.
- Nếu vi khuẩn sinh hơi thì thấy bọt khí trong ống Duhan và mực nƣớc trong ống Duhan bị tụt xuống.
Phản ứng thử Oxydaza
31
- Phƣơng pháp thử: Nhỏ 1 giọt thuốc thử ra giâý thấm vơ trùng, sau đó dùng que cấy bạch kim lâý khuẩn lạc của vi khuẩn cần thử di trên giấy đã thấm thuốc thử. Sau 10 giây nếu phản ứng dƣơng tính thì miếng giấy thấm sẽ xuất hiện lên màu tím, nếu âm tính thì màu sắc khơng đổi.
Phản ứng thử Catalaza
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ mơi trƣờng thạch đĩa, cho lên phiến kính sạch, sau đó nhỏ 1-2 giọt dung dịch 3 % H2O2 vào đó, nếu có sủi bọt là phản ứng dƣơng tính.
2.4.5. Phương pháp xác định Salmonella và E. coli bằng kỹ thuật PCR
2.4.5.1. Kỹ thuật tách DNA vi khuẩn gram âm Các bước tiến hành:
Pha 48mg Proteinase K dạng đông khô trong 2,4ml đệm tƣơng ứng (PK Storage buffer) đạt nồng độ 20mg/ml.
Trộn đều bằng máy vortex, sau đó chia đều ra các ống eppendorf, bảo