6. Bố cục luận án
2.2.6. Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các quần thể và các cá thể bằng
các cá thể bằng kỹ thuật phân tử ISSR và SCoT
Tại mỗi vùng phân bố tiến hành chọn thu mẫu lá từ 20 cây đại diện. Khoảng cách giữa các cây thu mẫu từ 200 m trở lên. Với các mẫu lá sau khi thu được, tiến hành đánh dấu ký hiệu sau đó lưu giữ cẩn thận trong silica gel cho đến khi đem về phịng thí nghiệm để xử lý. Thông tin các mẫu thu thập được trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2 Các mẫu được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền Ký hiệu mẫu Quần thể Vùng địa lý Kinh độ/vĩ độ
RhC1, RhC2, …, RhC20 Tuyền Lâm Hồ Tuyền Lâm 108°26'22.79"E, 11°52'13.16"N RhB1, RhB2, …, RhB20 Hòn Nga Núi Hòn Nga 108°14'10.43"E,
12° 1'16.64"N RhA1, RhA2, …, RhA20 Bidoup VQG Bidoup 108°34'57.43"E,
12° 9'12.35"N
a) Tách chiết DNA
Mẫu lá của từng cá thể thu thập được tiến hành tách chiết DNA theo quy trình CTAB I của Weising và cộng sự (2005) [115] có cải tiến bằng việc bổ sung SDS 10% vào thành phần đệm chiết. 2 đến 3 mẫu DNA được chiết xuất từ mỗi mẫu thu thập được từ thực địa. DNA tách chiết được hòa tan trong đệm TE. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA được đo bằng phương pháp đo quang phổ của Weising và cộng sự (2005) trên thiết bị NanoScan2 (Analytik Jena – Đức).
Các mẫu DNA sau khi được kiểm tra chất lượng được bảo quản ở điều kiện - 200C. Các mẫu đạt độ tinh sạch dựa trên tỷ lệ trị OD260/OD280 trong khoảng từ 1,7 đến 2,0 mới được sử dụng cho đánh giá đa dạng di truyền.
b) Phân tích DNA
Sử dụng kỹ thuật Inter simple sequence repeats (ISSR) và Start Codon Targeted (SCoT) để làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA (DNA fingerprint). Chỉ thị ISSR được tổng hợp bởi Công ty TNHH PhuSa Biochem (Việt Nam), theo bộ chỉ thị do Đại học British Columbia và Đại học Zagazig (Ai Cập) đề xuất (Admed, 2005) [41] và chỉ thị SCoT được cung cấp bởi Collard và Mackill (2009) [54].
Để làm nảy sinh DNA fingerprint DNA, 20 chỉ thị ISSR và 20 chỉ thị SCoT thử nghiệm để chọn lọc chỉ thị thích hợp. 5 mẫu DNA chọn ngẫu nhiên từ các mẫu thu thập được thử nghiệm khuếch đại với mỗi chỉ thị sử dụng bằng tiến trình khuếch
đại nêu trên để sàng lọc các chỉ thị với tiêu chí là ghi nhận được sản phẩm khuếch đại bằng PCR và có ít nhất 1 band đa hình.
Chín chỉ thị ISSR và 9 chỉ thị SCoT đáp ứng các tiêu chí đặt ra và được chọn và mô tả trong Bảng 2.3. Những chỉ thị chọn được sử dụng cho toàn bộ 60 mẫu Đỗ quyên lá nhọn thuộc ba quần thể nghiên cứu.
Bảng 2.3 Chỉ thị (markers) ISSR và SCoT được sử dụng trong nghiên cứu
c) Khuếch đại DNA
TT Ký hiệu chỉ thị Trình tự 3’ to 5’ Ta (oC)
Chỉ thị ISSR
1 UBC 17899 5'-(CA)6 A/G G-3' 54
2 HB 8 5'-(GA)6 GG-3' 52 3 HB12 5’-(CAC)3 GC-3’ 52 4 UBC 807 5'-(AG)8 T-3' 54 5 UBC 808 5' –(AG)8 C-3' 52 6 ISSR 814 5' –(CT)8 TG-3' 51.5 7 UBC 842 5'-(GA)8 T/C G -3' 51.5
8 UBC856 5'-(AC)8 T/C A-3' 52
9 UBC873 5'-(GACA)4 -3' 52 Chỉ thị ScoT 10 SCoT 1 CAACAATGGCTACCACCA 50 11 SCoT 9 CAACAATGGCTACCAGCA 50 12 SCoT 12 ACGACATGGCGACCAACG 50 13 SCoT 13 ACGACATGGCGACCATCG 50 14 SCoT 18 ACCATGGCTACCACCGCC 50 15 SCoT 19 ACCATGGCTACCACCGGC 50 16 SCoT 22 AACCATGGCTACCACCAC 50 17 SCoT 29 CCATGGCTACCACCGGCC 50 18 SCoT 30 CCATGGCTACCACCGGCG 50
Phản ứng PCR được thực hiện với dung tích 50 µL chứa 25 µL hỗn hợp My Red HS Taq (Bioline), 0,2µM chỉ thị và khoảng 30 ng DNA.
- Đối với kỹ thuật ISSR: bước biến tính ban đầu trong 5 phút ở 940C; 10 chu kỳ mỗi chu kỳ gồm 15 giây ở 940C, nhiệt độ gắn chỉ thị thích hợp +5 (Ta +5)0C trong 15 giây, giảm dần 0,50C/chu kỳ, kéo dài mạch ở 720C trong 45 giây; 30 chu kỳ trong 15 giây ở 940C, nhiệt độ ủ trong 15 giây, 720C trong 45 giây; bước kéo dài mạch cuối cùng ở 720C trong 10 phút.
- Đối với kỹ thuật SCoT: bước biến tính ban đầu trong 5 phút ở 940C; 36 chu kỳ mỗi chu kỳ 15 giây ở 940C, nhiệt độ gắn chỉ thị 500C trong 15 giây, kéo dài mạch ở 720C trong 45 giây; bước kéo dài mạch cuối cùng ở 720C trong 10 phút.
d) Ghi nhận các DNA fingerprint bằng các chỉ thị ISSR và SCoT
Các mẫu DNA có độ tinh sạch cao đại diện cho toàn bộ các mẫu thu thập được ký hiệu và sử dụng làm khuôn mẫu để thực hiện PCR. Việc khuếch đại được thực hiện theo mẻ riêng cho từng chỉ thị.
Sản phẩm PCR được kiểm tra độ đặc hiệu thông qua điện di trên gel agarose 2,5%, sử dụng đệm TBE ở 70V trong 2,5 giờ, nhuộm bằng Ethidium bromide (0,5 µg/mL) và chụp ảnh dưới ánh sáng bước sóng 254 và 312 nm sử dụng Hệ thống UVP GelStudio Plus (Analitik Jena, Đức).
e) Phân tích dữ liệu
Hai chỉ thị ISSR và SCoT là chỉ thị trội, mỗi dãy band DNA trên gel sau điện di được xem là đại diện cho một locus gồm hai allele (Williams và cộng sự, 1990) [118]. Các band ISSR và SCoT được ghi nhận về sự hiện diện (với ký hiệu là 1) hay vắng mặt (với ký hiệu là 0) để lập ma trận dữ liệu nhị phân theo từng chỉ thị sử dụng. Tổng hợp các ma trận nhị phân theo chỉ thị để xây dựng ma trận nhị phân tổng thể.
Sử dụng phần mềm Popgene 32 để tính tốn các thơng số cơ bản về đa dạng và biết động di truyền. Các thông số này bao gồm: Tỷ lệ phần trăm băng đa hình (percentage of polymorphic bands - PPB), mức độ dị hợp tử di truyền/chỉ số đa
(I), hệ số phân hóa gen (Nei’s coefficient of gene differentiation - GST), chỉ số dòng gen (Nm) và khoảng cách di truyền giữa các quần thể (the genetic distance between populations - D) (Yeh và cộng sự, 1999) [124].
Phân tích phương sai phân tử (AMOVA) được thực hiện bằng cách sử dụng chương trình GenAlEx 6.0 (Peakall & Smouse, 2006) [94] để mô tả sự phân bố của phương sai di truyền giữa và trong các quần thể được điều tra. Hệ số tương đồng di truyền theo cặp (GSC) giữa các mẫu điều tra, trung bình của chúng (AGSC) và biểu đồ hình ảnh UPGMA cho mối quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu được tính tốn và thiết lập bằng cách sử dụng phần mềm NTSYSpc 2.1 (Rohlf, 2004) [101].
Các thông số di truyền của ba quần thể điều tra được tính tốn dựa trên dữ liệu bằng kỹ thuật ISSR tạo ra (các thông số tương ứng được mã hóa là PPBI, HeI, II, GSTI, NmI, DI, GSCsI, AGSCI) và dữ liệu do kỹ thuật SCoT tạo ra (các thơng số
tương ứng được mã hóa là PPBS, HeS, IS, GSTS, NmS, DS, GSCss, AGSCs) riêng biệt để so sánh giữa hai kỹ thuật phân tích DNA. Sử dụng bộ dữ liệu kết hợp từ hai kỹ thuật, các thơng số di truyền cuối cùng được tính tốn và mã hóa là PPB, He, I, GST,
Nm, D, GSCs, AGSC.