(A) Nuôi cấy tế bào trên phiến vi lượng, (B) Chuẩn bị mẫu,
(C) Kit và thuốc thử,
(D) Thiết bị ghi ảnh hiển vi (tích hợp laser scanner), (E) Phần mềm phân tích,
Chương 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu.
Họat tính chống ung thư ở mức độ tế bào được sàng lọc trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa.
Đánh giá hoạt tính chống ung thư trên đích phân tử yếu tố nhân NF-κB ở tế bào HeLa sử dụng kỹ thuật phân tích hình ảnh huỳnh quang tế bào với kính hiển vi huỳnh quang tự động.
2.2. Nội dung nghiên cứu.
2.2.1.Thu thập mẫu, sàng lọc hoạt tính sơ bộ và nghiên cứu tối ưu kỹ thuật huỳnh quang tế bào.
2.2.2.Nghiên cứu thử nghiệm tác dụng của chất thử và phân tích các tín hiệu huỳnh quang đặc trưng.
2.2.3.Nghiên cứu phát hiện chuyển vị của yếu tố nhân NF-κB.
2.3. Vật liệu.
2.3.1.Dòng tế bào
Dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa (ATCC® CCL-2TM) sử dụng trong nghiên cứu được mua từ nguồn ATCC (American Type Culture Collection, Virginia, USA) và lưu giữ tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện Hóa học các HCTN).
2.3.2.Mẫu thử nghiệm
Mẫu sử dụng cho sàng lọc, đánh giá hoạt tính sinh học là các cao chiết từ nguồn thực vật, sinh vật biển hoặc các chất tinh sạch và bán tổng hợp (từ HCTN) được cung cấp bởi các đơn vị phối hợp như một số Viện nghiên cứu hóa học thuộc Viện Hàn lâm KHCNVN, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Viện Nghiên cứu và Phát triển Sản phẩm Thiên nhiên... Do các kết quả thu được trong nghiên cứu này chưa được công bố và thuộc khuôn khổ hợp tác với các đơn vị liên quan nên các mẫu được kí hiệu theo bảng sau:
Bảng 2.1: Danh sách các mẫu hóa học sử dụng trong nghiên cứu sàng một số hoạt chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học
TT Kí hiệu mẫu Loại mẫu
1 BHX-n, BHX-c, KhS-n, KhS-c, HyT-n, HyT-c, XaC-n, XaC-c, ToT-n, ToT-c, BCL-n, BCL-c
Mẫu cao chiết thực vật (bạch hoa xà, khổ sâm, hy thiêm, xạ can, tơm trơng, bán chi liên…) 2 Nitid, M1 – 7aa, M2 – 7ab, M3 – 7ac, M4 –
7ad, M5 – 7ba, M6 – 7bb, M7 – 7bc, M8 – 7bd, M9 – 7ca, M10 – 7cb, M11 – 7cc, M12 – 7cd
Mẫu thực vật tinh sạch
3 Mori, MurA, Inoxim, Zeru, Pice, SHTN- Zer4
Mẫu thực vật tinh sạch, dẫn xuất và chất bán tổng hợp 4 LCN, LCH, LCC, LCE, MN, DH, HD, DE,
ME, HT, DC, MH, DN, MC
Mẫu cao chiết, phân đoạn
5 Paclitaxel (taxol), Ellipticine Thuốc chống ung thư, sử dụng làm chứng (+)
* Các mẫu sử dụng trong luận văn này chỉ là minh chứng cho kết quả thử nghiệm sàng lọc và lựa chọn mẫu cho nghiên cứu tiếp theo trên các đích phân tử. Việc sử dụng kết quả về sàng lọc MTT đã được sự đồng ý của đơn vị gửi mẫu.
2.3.3. Môi trường nuôi cấy tế bào
- Môi trường nuôi cấy tế bào bao gồm: (EMEM, DMEM, Ham’s F12 medium, RPMI 1640 medium; ThermoFisher hoặc Sigma) có bổ sung 0,1% kháng sinh và 10% huyết thanh bê FBS (ThermoFisher hoặc Sigma), dung dịch đệm PBS 0,1 M, pH 7,8.
- 0.005 - 0.25% trypsin + 1 mM EDTA (ThermoFisher) - Dimethylsulfloxide (DMSO, Sigma, USA)
- 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; Sigma) - L-Glutamic acid monosodium salt hydrate (MSG, Sigma)
- Dung dịch nhuộm DAPI (dạng bột, ThermoFisher) - Paraformaldehyde (Sigma)
- Triton X-100 (Sigma)
- GFP: Green fluorescent protein (ThermoFisher)
2.3.4. Hóa chất và thiết bị.
2.3.4.1. Hóa chất
- Các loại muối: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4, L-Glutamic acid monosodium (MSG, Sigma).
- Các loại hóa chất cần thiết khác: DAPI (dạng bột, ThermoFisher), Triton X- 100 (Sigma), Paraformaldehyde, Dimethylsulfloxide (DMSO, Sigma, USA), 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT;Sigma), Trypsin, EDTA, GFP. (ThermoFisher)
- Nước cất.
- Tất cả dung dịch đệm và hóa chất sử dụng là tinh khiết và thích hợp trong nghiên cứu.
2.3.4.2. Thiết bị
- Tủ cấy vô trùng (Bio Clean Bench, Sanyo, Nhật) - Tủ ấm CO2 (Esco, Indonesia)
- Máy ly tâm (Hettich rotofix 32A, CHLB Đức)
- Máy ly tâm lạnh (Hettich universal 32R, CHLB Đức) - Tủ lạnh (Panasonic, Nhật)
- Tủ lạnh sâu (đến -86°C, Sanyo, Nhật), Bình nitơ lỏng (Chart BioMedical, Trung Quốc).
- Kính hiển vi soi ngược (Optika, Ý)
- Bể siêu âm (Daihan scientific, Hàn Quốc) - Máy đo quang (Infinite F50, Tecan, Thụy Sỹ)
- Hệ thống hiển vi huỳnh quang tự động Olympus scanˆR (Heidelberg, CHLB Đức) và phần mềm phân tích scanˆR Analysis Software.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Nuôi cấy và hoạt hóa tế bào
Tế bào ung thư được nuôi cấy ở 37 oC ở tủ ấm cấp CO2 5 % trong môi trường DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose; Sigma-Aldrich, USA)
có bổ sung L-glutamine 2mM, kháng sinh (Penicillin + Streptomycin sulfate) và huyết thanh bê (FBS 10 %). Sau khi tế bào phát triển đạt trên 70 %, loại bỏ môi trường cũ và rửa với dung dịch đệm phosphate (PBS 0,1 M, pH 7,8), sau đó bổ sung Trypsin-EDTA 0,05 % để tách tế bào bám dính khỏi đáy đĩa nuôi cấy. Dịch tế bào được chuyển sang ống falcon 15 mL có chứa 4-5 mL dịch môi trường mới và ly tâm 300 vòng/phút. Sau khi loại bỏ phần dịch, phần cặn tế bào được trộn với môi trường dinh dưỡng và được chuyển sang bình nuôi cấy mới để sẵn sàng cho các thử nghiệm hoạt tính.
Đây là nguồn mẫu cần thiết cho các phân tích sinh hóa của TB ung thư. Điều này mở ra cơ hội cho các nhà khoa học có điều kiện nghiên cứu, tìm hiểu sâu hơn về các đặc tinh sinh học, đồng thời xác định và mô tả đặc điểm của TB ung thư. Với mục đích sử dụng các dòng TB này để nghiên cứu hoạt tính của các hoạt chất kháng ung thư trong điều kiện in vitro [5].
2.4.2. Đánh giá hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào – phương pháp MTT
Nguyên tắc: Việc sử dụng thuốc nhuộm tetrazolium (MTT) làm phép đo chính xác số lượng TB đã được công bố từ đầu những năm 1980 [17]. Nguyên lý của phương pháp MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] dựa trên sự chuyển hóa MTT thành dạng tinh thể formazan bởi enzyme oxidoreductase phụ thuộc NAD(P)H của ty thể có liên quan tuyến tính với sự tăng hoặc giảm số lượng TB. Do đó, số lượng TB sống sót có thể được xác định gián tiếp bằng cách đo nồng độ hấp thụ MTT - formazan tại bước sóng = 570 nm. Trong quá trình phân chia TB, việc giảm số lượng TB phản ánh khả năng ức chế sự sinh trưởng của TB và hoạt tính cảu thuốc/chất thử sau đó được xác định dựa trên nồng độ của mẫu tại đó ức chế 50% sự phát triển TB so với đối chứng không xử lý với thuốc (giá trị IC50). Quy trình này dựa trên tài liệu tham khảo và được tối ưu trên các thử nghiệm với các chất thử và thuốc có độc tính TB để thu được kết quả phù hợp với thực nghiệm chuẩn [18].