2.3.2 .Mẫu thử nghiệm
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.2. Đánh giá hoạt tính ức chế sự tăng sinh tế bào – phương pháp MTT
Nguyên tắc: Việc sử dụng thuốc nhuộm tetrazolium (MTT) làm phép đo chính xác số lượng TB đã được công bố từ đầu những năm 1980 [17]. Nguyên lý của phương pháp MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] dựa trên sự chuyển hóa MTT thành dạng tinh thể formazan bởi enzyme oxidoreductase phụ thuộc NAD(P)H của ty thể có liên quan tuyến tính với sự tăng hoặc giảm số lượng TB. Do đó, số lượng TB sống sót có thể được xác định gián tiếp bằng cách đo nồng độ hấp thụ MTT - formazan tại bước sóng = 570 nm. Trong quá trình phân chia TB, việc giảm số lượng TB phản ánh khả năng ức chế sự sinh trưởng của TB và hoạt tính cảu thuốc/chất thử sau đó được xác định dựa trên nồng độ của mẫu tại đó ức chế 50% sự phát triển TB so với đối chứng không xử lý với thuốc (giá trị IC50). Quy trình này dựa trên tài liệu tham khảo và được tối ưu trên các thử nghiệm với các chất thử và thuốc có độc tính TB để thu được kết quả phù hợp với thực nghiệm chuẩn [18].
Hình 2.1: Cấu trúc phân tử của tetrazolium và formazan
Tiến hành: TB ung thư được nuôi cấy ở 37 oC (tủ ấm CO2 5%) trên phiến 96 giếng (1,5 x 105 tế bào/giếng) trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) hoặc EMEM (Eagle’s Minimum Esential Medium, Sigma-Aldrich, USA) bổ sung kháng sinh (Penicillin + Streptomycin sulfate) và huyết thanh bê 10%. Sau đó, TB được ủ với chất chuẩn Ellipticine (hoặc Paclitaxel) và các mẫu thử ở các nồng độ từ 0,1-100 g/mL (hoặc M), mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Sau quá trình phơi nhiễm, TB sẽ được nhuộm với chất nhuộm tetrazolium (MTT 10 ng; Sigma-Aldrich) trong 4 giờ. Cuối cùng, sản phẩm chuyển hóa thành tinh thể formazan sẽ được hòa tan trong Dimethyl sulfoxide (DMSO) và đo mật độ quang (OD) ở -540/720 nm (Infinite F50, Tecan, Thụy Sỹ).
Khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư ở nồng độ nhất định của chất thử tính theo % so với đối chứng theo công thức:
Tỷ lệ ức chế tế bào (%) = [1-(ODmẫu/ODđối chứng (-))] x 100%
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (% ức chế ≥ 50%) được xác định giá trị IC50 (g/mL hoặc M) là nồng độ của mẫu thử mà tại đó ức chế 50% sự sống sót của TB.