4. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
3.2.2. Thu nhận hình ảnh huỳnh quang
Tế bào HeLa được ủ với chất cảm ứng (IL-1 10 ng/mL), cố định tế bào và xử lý với thuốc nhuộm huỳnh quang như mô tử ở phần phương pháp ở trên. Trước khi tiến hành thu nhận hình ảnh nhuộm DAPI và GFP-p65, các mẫu đều được quét kiểm tra ở chế độ tự động lấy nét Autofocus ở tất cả các giếng để đảm bảo độ đồng nhất. Kết quả Autofocus được thể hiện ở dưới những hình sau. Cần nhấn mạnh rằng, quá trình chạy mẫu một cách tự động chỉ được thực hiện khi đường chuẩn chỉnh tinh và chỉnh thô cho ra một đường cong rõ nét.
Hình 3.4: Autofocus hình ảnh tế bào HeLa trên kênh lọc DAPI theo peak chỉnh tinh (Fine) và chỉnh thô (Coarse) trên trục Z
Từ những hình ảnh lấy nét Autofocus thu được như trên cho chúng ta thấy việc thu nhận và phân tích hình ảnh tự động của kính hiển vi huỳnh quang đạt đủ điều kiện để thực hiện những phân tích tiếp theo.
Để phát hiện NF-κB kích hoạt bởi TNF-, chúng tôi sử dụng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang với kháng thể sơ cấp anti-p65 NF-κB và liên kết huỳnh quang xanh phát hiện trên kênh GFP, kích thích ở λ=488nm. Đồng thời, nhân tế bào được nhuộm với huỳnh quang DAPI, kích thích ở λ=405nm. Kết quả thu được hình ảnh rõ, đủ chất lượng phân tích (Hình 3.5).
Hình 3.5: Tín hiệu protein huỳnh quang xanh gắn với tiểu đơn vị NF-κB p65 (GFP- p65), DNA nhân tế bào (DAPI) và chồng hình ảnh huỳnh quang (MERGE). Hình
ảnh được ghi trên thiết bị hiển vi huỳnh quang Olympus scanˆR. 3.2.3. Thiết lập thông số phân tích hình ảnh
Tương tự như phương pháp được đề cập ở trên, sau khi thu nhận được hình ảnh huỳnh quang, kết quả được phân tích off-line sử dụng phần mềm scanˆR Analysis ver.2.7.2. Phần mềm này cho phép phân tích tự động dựa trên các thông số thiết lập cho các đối tượng phân tử đích cần đánh giá. Để xác định và phân tích hình ảnh huỳnh quang, đối tượng được định dạng dựa trên công thức đẳng chu:
Trong đó :
fcirc: hệ số định dạng đối tượng phân tích (dạng cầu hoặc hình sao);
A: diện tích;
P: chu vi.
Từ sổ Modify Object Boundaries trong Assay Settings đặt thông số lựa chọn viền hình ảnh (Selectivity) theo hình ảnh thực từ tín hiệu huỳnh quang thu được. Đồng thời xác định kích thước tối đa khung đối tượng phân tích (Max. object size) sao cho xác định tối đa các đối tượng, mặt khác loại bỏ các nhiễu tín hiệu không đủ chất lượng phân tích. Như thể hiện trên nếu thông số viền phù hợp (Selectivity: 0,45) nhưng kích thước tối đa <<< kích thước hình ảnh thực (Max. object size: 50) dẫn tới vùng phân tích của đối tượng bị hạn chế ( sai số lớn khi phân tích kết quả). Ngược lại, nếu hệ số viền không phù hợp (Vd. Selectivity: 0.20) sẽ xuất hiện
nhiều vùng tín hiệu nhiễu. Trong thử nghiệm này, các thông số phù hợp được xác định với Selectivity: 0.45 và Max. object size: 100 (Hình 3.6).
Hình 3.6: Lựa chọn thông số xác định viền và kích thước hình ảnh đối tượng phân tíchtrên phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2
Để xác định sự chuyển vị NF-κB, đối tượng phân tích chính (Main Object) được lựa chọn là vùng DNA nhân tương ứng với kênh tín hiệu DAPI; đối tượng phụ (Sub- Object) là phức p65-GFP phát hiện trên kênh GFP ở tín hiệu hiệu tế bào chất được đặt là “CytoI” và Sub-Object thứ hai được lựa chọn là vùng nhân “NucCore”. Tối ưu các
Chọn viền đối tượng theo tín hiệu huỳnh quang (Selectivity)
Ngưỡng xác định kích thước tối đa (Max. object size)
Selectivity: 0.20 Max. object size: 100
Selectivity: 0.45
Max. object size: 100
Selectivity: 0.45
thông số trên phần mềm phân tích scanˆR Analysis, đường viền giữa Sub-Object và Main Object với khoảnh cách là -1 và độ rộng = 1 cho hình ảnh phân tách giữa các đối tượng tốt nhất. Sub-Object thứ hai (“NucCore”, kênh GFP) là phần bên trong đối tượng Main Object với khoảng cách mặc định -100, độ rộng = 98 (Hình 3.7).
Hình 3.7: Tạo thông số xác định đường viền đối với đối tượng phân tích chính Main Object (kênh DAPI) và phần Sub-Object (tương ứng vùng tế bào chất
“CytoI”, kênh GFP). Hình ảnh đường viền phân tách tốt với khoảng cách (distance) = -1.
3.2.4. Phân tích hình ảnh chuyển vị NF-κB
Trước hết, vùng tín hiệu nhân tế bào được khư trú sử dụng một trong các thuốc nhuộm huỳnh quang đặc hiệu DAPI. Nhân tế bào được xác định theo phân vùng hình ảnh phân tích (mask) như mô tả ở trên, sau đó kỹ thuật chồng hình ảnh thứ hai (mask overlay/merge) được tạo từ viền bao quanh toàn bộ tế bào hoặc vùng giới hạn nằm trong tế bào chất. Nhờ đó NF-κB gắn huỳnh quang có thể được định lượng qua phân vùng thứ hai này (nhân hoặc/và tế bào chất). Trong sàng lọc các chất có hoạt tính, sử dụng cường độ tín hiệu vùng nhân và tế bào chất cũng có thể phát hiện đồng thời các hợp chất có huỳnh quang trùng hoặc gần với phổ của chất dò (kit nhuộm) tương ứng sử dụng khi phát triển phương pháp thực nghiệm. Khi đó những hợp chất này được đưa vào nhóm mẫu "dương tính giả" (false positive) và cần xác định mức tín hiệu "tự phát huỳnh quang" trong tế bào khi có và không có mặt của chất dò.
Mỗi tế bào trong trường phân tích được xác định số lượng và phân định bởi đường viền quanh nhân (đường màu đỏ). Để giảm tín hiệu nhiễu vùng tế bào chất, vòng đường viền thứ hai phía trong (màu xanh) được tạo khi phân tích định lượng. Lượng protein xác định ở vùng tế bào chất và trong nhân là kết quả trung bình tín hiệu huỳnh quang đo được theo diện tích của mỗi vùng phân định. Như vậy trước khi kích thích tế bào, vùng tế bào chất sẽ có màu xanh đậm so với màu sáng ở vùng nhân. Ngược lại, khi kích thích tín hiệu huỳnh quang vùng tế bào chất giảm và tăng lên trong nhân do có sự di chuyển của protein từ vùng tế bào chất, đồng nghĩa với tỷ lệ Nuc/Cyto tăng. Cần lưu ý rằng, việc đo/quan sát từ hướng trên hoặc dưới phiến tế bào có thể có hiện tượng chồng lấn do các vùng nhân trùng nhau ở các tế bào khác phía trên hay dưới nó, do vậy phân tích yêu cầu kỹ thuật quét lớp và quan sát theo hướng cạnh tế bào.
Các tế bào không chỉ được được nhuộm với kháng thể đặc hiệu p65 để xác định NF-κB ở mỗi tế bào riêng biệt mà còn được nhuộm với kit đặc hiệu để xác định nhân của tất cả tế bào trong giếng hay vùng phân tích. Phần mềm Olympus scanˆR Analysis cho phép định rõ vùng nhân và đường viền bằng phương pháp giới hạn theo động học (dynamic threshold) qua sự thay đổi tín hiệu huỳnh quang trên vùng nền. Theo đó khi kích thích tế bào HeLa với IL-1 và có sự chuyển vị của protein tiểu đơn vị p65, vùng xanh đậm được xác định trong nhân với vùng giới hạn là đường màu xanh và vùng tế bào chất nằm giữa đường phân định của nhân và đường viền màu đỏ như ở (Hình 3.8)
Hình 3.8: Phân tích hình ảnh thực trên phần mềm Olympus scanˆR Analysis ver.2.7.2. Tế bào HeLa kích hoạt NF-κB bởi IL-110 ng/mL trong 30 phút.
Hệ số Z' và đánh giá khả năng thử nghiệm sàng lọc hiệu năng cao
Mức độ chuyển vị của yếu tố nhân NF-κB từ tế bào chất vào nhân có thể biểu thị theo 2 phương pháp: (i) Theo hiệu số cường độ huỳnh quang của NF-κB trong nhân và vùng tế bào chất (Nuc-Cyto). Phương pháp này trước đây thường được áp dụng, tuy nhiên kết quả biến thiên lớn do tín hiệu huỳnh quang trong mỗi tế bào đơn lẻ thường có sự thay đổi đánh kể; (ii) Theo tỷ lệ cường độ huỳnh quang trong nhân và vùng tế bào chất (Nuc/Cyto; Hình 3.9&3.10). Ở phương pháp này có sai số (error) thấp nên giá trị Z’ thường cao hơn ở các thử nghiệm mức độ tế bào.
Hình 3.9: Phân tích sự chuyển vị NF-κB theo tỷ lệ huỳnh quang của protein p65 vùng tế bào chất và trong nhân (Nuc/Cyto) sử dụng phần mềm Olympus scanˆR
Analysis ver.2.7.2
Positive
Để xác định hệ số Z’, 2 nhóm đối chứng (control) và mẫu bổ sung chất kích hoạt chuyển vị (vd. IL-1) phân đều trên phiến 96 giếng với n = 48 giếng. Hệ số Z' không khác biệt đáng kể ở hai phương pháp, theo đó giá trị Z' xác định lần lượt là 0,70 đối với Nuc-Cyto và 0,73 cho Nuc/Cyto. Về lý thuyết, Z'-factor trong khoảng 0,5 đến ~1,0 được đánh giá nhóm thử nghiệm tốt, độ tin cậy cao (excellent assay). Mặt khác, biểu đồ phân tán cho thấy sự phân tách rõ rệt của 2 nhóm control và bổ sung IL-1 (Hình 3.10). Kết quả này cho thấy có thể phát triển kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang ứng dụng cho các thử nghiệm hiệu năng cao HTS. Điều này là phù hợp về lý thuyết hệ thống Olympus scanˆR được thiết kế cho sàng lọc HTS và độ chính xác cao nhờ kỹ thuật lấy nét tự động (autofocus) và xác định vị trí đối tượng phân tích độc lập.
Điều này cho phép thực hiện các thử nghiệm quy mô lớn, tiết kiệm thời gian, kinh phí và đảm bảo độ chính xác của kết quả truy suất. Do hệ số Z' cao hơn nên chúng tôi sử dụng thông số tỷ lệ Nuc/Cyto trong các phân tích kết quả hình ảnh chuyển vị NF-κB đánh giá hoạt tính kháng viêm in vitro. Cũng lưu ý là, quy trình phát hiện và phân tích sự chuyển vị NF-κB bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang sử dụng hệ thiết bị sàng lọc/phân tích nội hàm cao HCS (Olumpus scanˆR) có thể phát triển ứng dụng cho phân tích các phân tử đích protein khác với đặc tính tương tự (chuyển vị nội bào tế bào chất - nhân), ví dụ như đối với NRF2 (nuclear factor erythroid-related factor 2) - một yếu tố phiên mã liên quan đến stress oxy hóa, ung thư và quá trình viêm.
Hình 3.10: Xác định hệ số Z' đối với nhóm đối chứng (control) và tế bào HeLa kích hoạt với cytokine (hình-bảng trên). Biểu đồ phân tán cường độ tín hiệu vùng tế bào
chất và trong nhân với đối chứng Control (-) và kích hoạt với IL-1 (hình dưới).
● (+IL-1)
● Control
Nuc-Cyto Control (-) +IL-1
Mean -47.102 510.065
%CV 5.1 11.3
Z'-factor 0.70
Nuc/Cyto Control (-) +IL-1
Mean 0.712 1.901
%CV 4.4 3.9
3.2.5. Thử nghiệm hoạt tính ức chế chuyển vị NF-κB trên tế bào HeLa
Hợp chất ký hiệu SHTN-Zer4 được đánh giá khả năng điều hòa/ức chế yếu tố kappa B (NF-κB) trên tế bào ung thư cổ tử cung HeLa dựa trên sự chuyển vị NF-κB (p65 gắn với protein huỳnh quang xanh GFP) từ bào tương (trạng thái không hoạt động) vào trong nhân (trạng thái hoạt động).
Kết quả phân tích cho thấy 2 vùng “clouds” tương ứng với nồng độ p65 trong bào tương (“negative”) cao so với trong nhân TB, trong khi ở mẫu đối chứng tín hiệu huỳnh quang vùng tế bào chất thấp do lượng lớn p65 NF-κB di chuyển vào nhân (“positive”) sau khi kích hoạt với IL-1. Theo đó nồng độ NF-κB trong bào tương cao (82 %) sau khi xử lý tế bào HeLa với chất thử SHTN-Zer4 (25 µg/mL) so với mẫu không xử lý (19,4 %). Kết quả logic là nồng độ NF-κB trong nhân được xác định đối với mẫu xử lý SHTN-Zer4 chỉ ở mức 8,2 % so với 70 % ở mẫu đối chứng (Hình 3.11).
Hình 3.11: Hợp chất SHTN-Zer4 điều hòa/ức chế yếu tố kappa B (NF-κB) của tế bào ung thư cổ tử cung HeLa qua đánh giá dựa trên sự chuyển vị NF-κB (p65
gắn GFP). Nhân được xác định đồng thời với nhuộm DAPI.
Positive Negative Counts % Counts % Cells in all 732.0 100.0 720.0 100.0 Cells in "Positive" 600.0 82.0 140.0 19.4 Cell in "Negative" 60.0 8.2 504.0 70.0 Control SHTN-4
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
Từ những kết quả thực nghiệm và phân tích số liệu, kết quả cho thấy như sau: -Đã sàng lọc hoạt tính ức chế tăng sinh đối với dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa từ 30 các mẫu cao chiết và chất tinh sạch., trong đó 5 mẫu ký hiệu SHTN-Zer4, MurA, Inoxim, DH và MH có biểu hiện hoạt tính.
-Đã nghiên cứu tối ưu các thông số để thu được hình ảnh huỳnh quang đảm bảo đủ chất lượng phân tích. Qua đó có thể phát hiện và định lượng sự chuyển vị protein nội bào của yếu tố nhân NF-κB từ tế bào chất (Cyto) vào nhân (Nuc). Giá trị hệ số Z' được xác định là 0,70 đối với Nuc-Cyto và 0,73 cho Nuc/Cyto do đó phương pháp có độ tin cậy cao và có thể ứng dụng trong sàng lọc hiệu năng cao.
-Mẫu ký hiệu SHTN-Zer4 được đánh giá hoạt tính ức chế ung thư in vitro trên dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa bằng kỹ thuật miễn dịch hiển vi huỳnh quang. Kết quả cho thấy ở nồng độ 25 µg/mL có hoạt tính ức chế chuyển vị NF-κB (chỉ 8.2% tổng NF-κB chuyển vị so với mẫu đối chứng tương ứng là 70%).
2. Đề nghị
Quy trình phát hiện và phân tích sự chuyển vị NF-κB bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang có thể phát triển ứng dụng cho phân tích các phân tử đích protein khác với đặc tính tương tự (chuyển vị nội bào tế bào chất - nhân), ví dụ như đối với NRF2 (nuclear factor erythroid-related factor 2) - một yếu tố phiên mã liên quan đến stress oxy hóa, ung thư và quá trình viêm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Thị Ngọc Ánh (2012), “Nghiên cứu khả năng chống ung thư của các hoạt chất lập từ cây vông nem (Erythrina orientalis (L.) Murr., Fabaceae) và cây hậu phác (Magnolia offcinalis Rehd. Et Wils, Magnoliaceae)”, Luận văn Thạc sĩ Khoa học, tr.1.
2. Nguyễn Thanh Bình (2015) “Xác định giá trị và tính khả thi của phương pháp quan sát với acid acetic (VIA) trong sàng lọc ung thư cổ tử cung tại Bắc Ninh và Cần Thơ, một số yếu tốt liên quan đến ung thư cổ tử cung”, Luận án Tiến sĩ y tế công cộng, tr. 5-17.
3. Phan Quốc Kinh (2011) “Giáo trình các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học”, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam, tr.4.
4. Đinh Đoàn Long (2012) “Phát triển phương pháp đánh giá tương tác với protein thụ thể không dùng chất phóng xạ phục vụ chiến lược sàng lọc các hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn dược liệu Việt Nam”, tr. 1-4.
5. Tạ Ngọc Tuyết Minh (2004) “Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung”, tr. 18-19.
II. Tài liệu tiếng Anh
6. Abdulla M., Gruber P. (2000) “Role of diet modification in cancer prevention”, BioFactors, vol 12, P. 45-51.
7. Anh P. T. H., Duc N. B. (2002) “The situation with cancer control in Vietnam.”,
Jpn. J. Clin. Oncol., vol 32, Supplement, P. S92-S97.
8. Ding JM, Buchanan GF, Tischkau SA, Chen D, Kuriashkina L, Faiman LE, Alster JM, McPherson PS,Campbell KP, Gille MU (1998) “A neuronal ryanodine receptor mediates light-induced phase delays of the circadian clock.” Nature 394:381–384
9. Etrych T., Lucas, H., Janoušková, O., Chytil, P., Mueller, T., Mäder, K. (2016) Fluorescence optical imaging in anticancer drug delivery. J. Control. Rel. 226: 168-181.
10. Escasrcega RO et al (March 2007). “The transcription factor nuclear factor- kappa B and cancer”. Clinical Oncology, vol 19.
11. Hattersley L. (2013) “A second opinion – An insight into good health, disease and our relationship with them”, Lulu Press. Inc, ISBN: 978-1291038941. 12. Hsiao, Y-C, Wang, K-S., Tsai, S-H., Chao, W-T., Lung, F-D.T. (2013)
Anticancer activities of an antimicrobial peptide derivative of Ixosin-B amide. Bioorgan. Medicin. Chem. Lett. 23: 5744-5747.
13. Kurzawa L., Nhu T., Van N., Morris M. C., Pr C. (2014) Fluorescent biosensors for drug discovery new tools for old targets e Screening for inhibitors of cyclin-dependent kinases” Eur. J. Mes. Chem., vol 88, P. 74-88.
14. Koziolova, E., Janouskova, O., Chytil, P., Studenovsky, M., Kostka, L., Etrych, T. (2015) Nanotherapeutics with anthracyclines: methods of determination and quantification of anthracyclines in biological samples. Physiol. Res. 64: S1–S10.
15. Li YY, Chung GT, Lui VW, To KF, Ma BB, Chow CC, et al. (January 2017). “Exome and genome sequencing of nasopharynx cancer identifies NF-B pathway activating mutations”. Nature Communications.
16. Lundstrom KH, Chiu ML (2006) G protein-coupled recceptors in drug discovery, CRC Press.
17. Mosmann T. (1983) “Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays” J. Immunol. Methods, vol 65, P. 55-63.
18. Plumb J. a, Milroy R., Kaye S. B. (1989) “Effects of the pH Dependence of 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium Bromide-Formazan Absorption on Chemosensitivity Determined by a Novel Tetrazolium-based Assay1”, Cancer Res., P. 4435-4440.
19. Prével, C., Kurzawa, L., Van, T.T.N., Morris, M.C. (2014) Fluorescent biosensors for drug discovery new tools for old targets - Screening for