2.3.2 .Mẫu thử nghiệm
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.4. Cố định tế bào
Trong một số trường hợp, ví dụ như khi cần lưu mẫu trong thời gian ≥ 1 giờ, bước cố định tế bào cần được thực hiện và có thể đảm bảo lưu giữ mẫu trong 1 tuần. Tế bào có thể cố định bằng dung môi hữu cơ, ở đây trình bày quy trình sử dụng paraformaldehyde theo tác giả Harlow & Lane (2006).
Xử lý tế bào với paraformaldehyde dẫn đến việc hình thành các liên kết ngang giữa các nhóm amin tự do. Khi liên kết hóa học hình thành giữa các phân tử khác nhau, mạng lưới các liên kết sẽ hình thành và kết nối cấu trúc tổng thể của các tế bào với nhau.
Các bước tiến hành:
1. Chuẩn bị dung dịch paraformaldehyde 3,7 % trong đệm phosphate (PBS, pH 7,4; pha mới khi sử dụng hoặc giữ ở -20 oC).
2. Rửa phiến tế bào với PBS.
3. Đổ bỏ phần nước/đệm nhưng không được để mẫu bị khô.
4. Cố định tế bào với 100 µL dung dịch paraformaldehyde 4 % trong PBS ở nhiệt độ phòng trong 10-20 phút.
5. Rửa tế bào 2 lần bằng PBS.
6. Thẩm thấu các tế bào đã được cố định bằng cách ủ 5 phút trong 100 µL dung dịch Triton X-100 0,1-0,2 % trong PBS (= PBST) ở nhiệt độ phòng.
7. Rửa 2 lần bằng dung dịch đệm PBS 0,1 M, pH 7,8. 8. Mẫu đã sẵn sàng cho các bước xử lý kháng thể tiếp theo.
Protein NF-κB ở tế bào HeLa có thể ổn định trong một vài ngày ở 4 oC trước khi nhuộm với kháng thể NF-κB và cố định với paraformaldehyde 3,7-4 %. Do vậy sau khi nhuộm huỳnh quang cần thực hiện ghi ảnh sớm nhất có thể và không quá 2 tuần.
Đánh giá hiệu suất sàng lọc qua hệ số Z’
Hệ số Z’ [30] được sử dụng để đánh giá hiệu suất thử nghiệm sàng lọc hiệu năng cao. Tế bào được xử lý với TNFα và cố định như trên. Thử nghiệm với n=45 giếng đối chứng và mẫu có bổ sung cytokine. Hệ số Z’ được xác định theo công thức:
Trong đó: µ là giá trị trung bình σ- độ lệch chuẩn.
p: positive control,
n: negative control.