1.1 .Tầm quan trọng và ý nghĩa của vấn đề cần nghiên cứu
1.2. Tổng quan về các vấn đề nghiên cứu
1.2.6. Sàng lọc hoạt tính chống ung thư dựa trên phân tích hình ảnh huỳnh
quang tế bào và đích phân tử
Bắt đầu từ các năm 1950, các mô hình sàng lọc trực tiếp trên TB ung thư đã được sử dụng để thay thế cho mô hình sàng lọc trên TB bình thường và vi khuẩn. Tại Viện Ung thư quốc gia (Mỹ) các mô hình TB được phân lập từ các loại khối ung thư mô liên kết (sarcoma 180), ung thư bạch cầu ác tính (L1210 leukemia) và ung thư biểu mô (carcinama 755) của chuột đã được sử dụng để triển khai các chương trình sàng lọc quy mô lớn.
Từ những năm 90, các mô hình sàng lọc trên các dòng TB ung thư của người đã được sử dụng thay thế các mô hình sàng lọc trên TB ung thư nguồn gốc động vật. Ngân hàng dữ liệu với 60 dòng TB đại diện cho các loại ung thư não, ung thư đại tràng, ung thư bạch cầu, ung thư phổi, ung thư buồng trứng và ung thư thận, bao gồm các dòng TB kháng thuốc đã được thành lập tại Viện Ung thư quốc gia (Mỹ)
và sử dụng để tăng hiệu quả sàng lọc thông qua các phương thức sàng lọc đơn, sàng lọc kép và sàng lọc chéo. Những cải tiến này có ý nghĩa quan trọng đối với lĩnh vực nghiên cứu sản xuất thuốc điều trị ung thư, về cả phương diện kinh tế và phương diện y dược. Mặc dù các dòng TB ung thư của động vật vẫn còn được sử dụng, kết quả khảo sát về hiệu quả sàng lọc trong quá trình chuyển giao từ nghiên cứu trên mô hình động vật sang nghiên cứu thực nghiệm lâm sàng trên người cho thấy không phải lúc nào các mô hình này cũng có khả năng đưa ra các kết luận đáng tin cậy. Theo kết quả điều tra thống kê tới năm 2004 của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm (Bộ Y tế và Dịch vụ Nhân sinh Mỹ, 2004), chỉ có 8% trong số 1/3 số thuốc dược khảo sát vượt qua giai đoạn thử nghiệm lâm sàng pha I. Một trong các nguyên nhân dẫn tới sự rơi rụng này là sự khác biệt về các đặc điểm sinh học giữa các mô hình trên động vật và trên người ở các mức độ hoạt động di truyền phân tử, miễn dịch và TB đã hạn chế quan trọng khả năng mô phỏng chính xác các phản ứng tiến triển trên người
Hiện nay, sàng lọc hoạt tính chống ung thư in vitro thường được đánh giá qua hoạt tính gây độc tế bào (cytotoxicity), ức chế sự tăng sinh tế bào (antiproliferation), kích thích sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis) thông qua biểu hiện của protein p53, Bax, Bcl-XL/BH3, hoạt tính enzyme caspase-3/7; hoạt tính ức chế aurora kinase, serine/threonine kinase, DNA topoisomerase I, kháng NF-KB (liên quan quá trình viêm và ung thư), phosphoryl hóa, ty thể, chu kỳ TB, chuyển vị nội bào,… sử dụng các kỹ thuật như MTT, Western blot, SEAP-assay, trắc lưu tế bào (flow cytometry), miễn dịch huỳnh quang và phân tích hình ảnh hiển vi tế bào,… Trong đó, tất cả các chiến lược sàng lọc in vitro tìm kiếm các chất hoạt tính sinh học có thể chia thành 2 nhóm phương pháp: (i) sàng lọc trên mức độ (toàn bộ) tế bào và (ii) sàng lọc trên đích là các phân tử đặc hiệu. Mặc dù chiếm số lượng lớn so với thư viện các chất tổng hợp, các HCTN trong mẫu chiết dường như không hoàn toàn phù hợp cho sàng lọc hiệu năng cao (High Throughput Screening-HTS) trên đích là các phân tử đặc hiệu. Ngược lại, có thể dễ dàng nâng cao hiệu quả sàng lọc ở mức độ tế bào, nhưng nhóm phương pháp này không cung cấp được thông tin về phương thức
hay đích tác động của chất thử, do vậy sẽ khó khăn trong lựa chọn ưu tiên chất tiềm năng cho những nghiên cứu tiếp theo (trên mô hình động vật và lâm sàng).
Nhiều cải tiến trong công nghệ sàng lọc đã được phát triển với mục đích phối hợp được cả hai phương pháp trên. Một trong những công nghệ đó là kỹ thuật ghi hình ảnh tế bào sử dụng kính hiển vi huỳnh quang tự động để quan sát ảnh hưởng của chất thử lên chức năng sinh lý và kiểu hình trong quá trình phát triển của tế bào. Bằng việc sử dụng các marker huỳnh quang tương thích sinh học có thể đưa ra các chẩn đoán về phương thức tác động của chất dựa vào “dấu vân tay” (fingerprint) kiểu hình của tế bào. Do vậy, kỹ thuật sàng lọc dựa trên phân tích hình ảnh tế bào đang là nhân tố cốt lõi trong khoa học sự sống cũng như nghiên cứu phát triển thuốc hiện đại (tín hiệu tế bào, các bệnh lý thần kinh, ung thư và độc tính thuốc).
Trong lĩnh vực tìm kiếm các thuốc chống ung thư, kỹ thuật phân tích huỳnh quang tế bào có thể được sử dụng để đánh giá tác dụng của chất thử lên các quá trình apoptosis, chu trình tế bào (cell cycle), chuyển vị nội bào và di căn. Presvel và cộng sự đã phát triển kỹ thuật huỳnh quang phục vụ sàng lọc hiệu năng cao các chất điều trị ung thư mới hướng đích là các kinase phụ thuộc cyclin (Cyclin-dependent kinases, CDKs) – enzyme có vai trò quan trọng trong điều khiển chu trình tế bào sống và biểu hiện cao ở hầu hết các bệnh ung thư người [13]. Phương pháp huỳnh quang được phát triển sử dụng cảm biến protein/peptide sinh học là công cụ có độ nhạy cao để phát hiện những thay đổi về thành phần, hoạt tính và trạng thái cấu trúc của các CDK/Cyclin trong nghiên cứu phát triển thuốc chống ung thư. Sử dụng kỹ thuật huỳnh quang tế bào phân tích trên thiết bị KineticScan HCS Reader (ThermoFisher, USA), [26] đã chứng minh hoạt tính chống ung thư gan của triterpene jaspolide B phân lập từ loài bọt biển Jaspis sp. trên 2 dòng tế bào ung thư biểu mô tế bào gan người Bel-7402 và Hep-G2 (với giá trị IC50 lần lượt là 29,1 và 29,5 M) qua hoạt tính cảm ứng apoptosis (tế bào Bel-7402 lên tới 66,8% ở nồng độ 0,5M) và đích ty thể. Trong khi đó [12] đánh giá hoạt tính chống ung thư của các peptide dẫn xuất của Ixosin-B amide cho thấy không chỉ ức chế hiệu quả đối với sự tăng sinh tế bào (IC50 = 61.5µM) mà còn tác động lên cấu trúc khung tế của bào ung thư vú MCF-7 ở nồng độ 25µM.
Hình 1.5: Ảnh hưởng của peptide dẫn xuất Ixosin-B amide (MAP-04-03; 25µM) đến sự thay đổi cấu trúc khung và hình thái tế bào ung thư vú MCF-
7. F-actin (xanh sẫm), -tubulin (xanh lá cây), và nhân TB (màu đỏ)
được quan sát sau khi nhuộm tương ứng với phức TRITC-Phalloidin, AlexaFluor488-IgG và propidium iodide (PI)
Trong vài thập kỷ qua, Viện Nghiên cứu ung thư quốc gia Mỹ (National Cancer Institute, NCI) đã phát triển và thực hiện các test sàng lọc HCS/A qua quan sát sự hình thành nhân TB, các biến đổi hình thái tế bào và chuyển vị protein. Ứng dụng kỹ thuật HCS/A, các nhà nghiên cứu tại NCI đã xác định được các chất điều biến phân chia tế bào mới với các cơ chế tác động lên sự phân hủy vi ống TB khác nhau, secramine (chất ức chế polymer hóa acetin) và một số chất điều biến chuyển vị protein NFAT (Nuclear factor of activated T-cells) và FOXO1 (Forkhead box protein O1) trong nhân TB [22]. Hơn nữa, qua phân tích chu trình tế bào (cell cycle) và sự thay đổi cấu trúc sợi vi ống xác định được jaspolide B ức chế phase G1 của chu trình tế bào và sự phân tách vi ống cấu trúc TB ung thư gan [26]. Trên mức độ tế bào, các TB khối u tuần hoàn trong máu (circulating tumor cells, CTCs) là các tế bào hiếm gặp (1 tế bào CTC/1 triệu TB máu) nên việc nghiên cứu gặp nhiều khó khăn. Sự tồn tại của các CTCs trong máu, có thể được giải phóng vào hệ tuần hoàn từ khối u ác tính nguyên phát hoặc di căn, đã được ghi nhận cách đây hàng trăm năm và giá trị của của chúng trong chẩn đoán và điều trị ngày càng được đánh giá cao trong những thập kỷ vừa qua. Một số phương pháp đã được phát triển gần đây nhằm phát hiện các tế bào khối u CTCs cho chuẩn đoán và đánh giá hiệu quả của các thuốc chống ung thư. Trong đó xác định CTCs từ mẫu máu bằng phương pháp
miễn dịch sử dụng hệ thiết bị CellSearch® CTC Test (Velidex, USA) đã được FDA chứng nhận ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư từ 2004. Tuy nhiên, phương pháp phân tích này tốn nhiều thời gian do vậy gần đây các nhà khoa học tại Đại Học Tokyo phối hợp với Công ty Hitachi Chemical Co., Ltd. (Nhật Bản) đã xây dựng phương pháp xác định nhanh CTCs dựa trên hình ảnh tế bào sử dụng thiết bị hiển vi huỳnh quang trường rộng (wide-field fluorescence imaging system) với thời gian phân tích trong vòng 1h [28].
Nhiều kỹ thuật mới vẫn đang được phát triển dựa trên công nghệ hình ảnh huỳnh quang và HCS/A ứng dụng trong nghiên cứu dược động học và sự phân tán thuốc in vitro. Mặc dù một số thuốc, như doxorubicin hoặc ellipticine có thể trực tiếp quan sát hình ảnh huỳnh quang, nhưng phần lớn các hệ thống phân tán thuốc cần ghi nhãn huỳnh quang để có thể quan sát trên thiết bị hiển vi.Ví dụ: sự vận chuyển thuốc chống ung thư doxorubicin(Dox) bởi polymer pHPMA (phức pHPMA-Dox) trong tế bào ung thư trực tràng DLD1 đã được xác định.
Hình 1.6: Hình ảnh huỳnh quang (quan sát trên kính hiển vi huỳnh quang Olympus IX8) của dòng tế bào ung thư trực tràng DLD1 xử lý với doxorubicin (Dox; nồng độ 1μg/mL) hoặc phức hợp pHPMA-Dox.A- sau 6h ủ với pHPMA-Dox;B- sau 6hủ với Dox; C- sau 24h xử lý vớipHPMA-Dox; D- sau 24hxử lý với pHPMA-Dox. Phức hợp pHPMA-Dox được nhuộm huỳnh quang Dyomics 676 có màu vàng phối hợp củaDox (xanh) và polymer pHPMA (màu đỏ)
Sau 6h xử lý với PHPMA-Dox, tín hiệu huỳnh quang Dox yếu được phát hiện trong màng tế bào và tế bào chất nhưng ngoài nhân. Trong khi đó, chỉ xử lý với thuốc Dox, tín hiệu huỳnh quang mạnh được quan sát thấy trong nhân.Sau 24h xử lý với pHPMA-Dox, Dox đã được chuyển vào nhân tế bào và tín hiệu huỳnh quang cũng được quan sát thấy trong tế bào chất. Như vậy, khi thuốc Dox gắn với pHPMA sẽ cần thời gian lâu hơn để phân tán trong nội bào và giải phóng khỏi chất mang [9], [14]. Việc đánh giá phân tán thuốc in vitro trên các dòng tế bào ung thư cũng có thể thực hiện trong trường hợp khi đánh giá in vivo trên mô hình động vật thực nghiệm không hiệu quả.
Ngoài ra, nghiên cứu phát hiện chuyển vị của yếu tố nhân NF-κB trong các thử nghiệm mức độ tế bào thường gặp nhiều khó khăn do các tương tác protein nội bào xẩy ra nhanh và phức tạp. Kỹ thuật chuyển gel hay di động điện di EMSA (electrophoretic mobility shift assay) thường được sử dụng để phát hiện liên kết đặc hiệu NF-κB và DNA hoặc có thể sử dụng kỹ thuật Western blot. Một trong các nhược điểm của phương pháp EMSA và Western blot là chúng không cung cấp đầy đủ thông tin trong mẫu phân tích phức tạp, do đó thiếu độ tin cậy. Ví dụ, khi quan sát giảm 50% độ mạnh tín hiệu phát hiện được không đồng nghĩa với việc giảm 50% trong 100% quần thể đó. Mặt khác các phương pháp hóa sinh-phân tử này cũng không đủ nhạy để phát hiện các hiện tượng hiếm khi chỉ thực hiện trên số lượng tế bào hạn chế. Trong khi đó phân tích trắc lưu tế bào Flow cytometry có thể cung cấp nhiều dữ liệu từ số lượng lớn tế bào thử nghiệm, tuy nhiên rõ ràng kỹ thuật này không thể thu được các dữ liệu phân tích nội bào từ các tín hiệu huỳnh quang. Những hạn chế kể trên có thể được khắc phục bằng kỹ thuật phân tích hình ảnh tế bào và chuyển vị nội bào sử dụng thiết bị hiển vi huỳnh quang.
Hình 1.7: Hệ thống sàng lọc/phân tích hiển vi huỳnh quang
(A) Nuôi cấy tế bào trên phiến vi lượng, (B) Chuẩn bị mẫu,
(C) Kit và thuốc thử,
(D) Thiết bị ghi ảnh hiển vi (tích hợp laser scanner), (E) Phần mềm phân tích,