CHƯƠNG 1 .TỔNG QUAN
1.7. Giới thiệu phương pháp sắc ký lỏng ghép nối khối phổ (LC-MS)
Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng tách vật lý của sắc ký lỏng với khả năng phân tích khối lượng của phép đo phổ khối (MS). Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách và phép đo phổ khối được sử dụng để phân tích tỷ lệ khối lượng điện – điện tích của các hạt tích điện. Sự phân tách vật lý thường đạt được bằng HPCL và cách khác. LC- MS còn được gọi là HPLC-MS.
LC-MS là một kỹ thuật đầy tiềm năng được ứng dụng ngày càng rộng rãi vì có tính chọn lọc và độ nhạy cao, giới hạn phát hiện có thể đến 10 -14 gam, thời gian phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu gần giống nhau mà các phương pháp sắc ký lỏng thông thường không làm được.
a) Hệ thống HPLC
HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữu hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thành phần pha động đưa chất phân tích qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý.
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm có các bộ phận cơ bản như sau (Hình 1.6):
24
Hình 1.6. Sơ đồ hệ thống HPLC
Trong đó:
1: Bình chứa pha động 5: Cột sắc ký (pha tĩnh) 2: Bộ phận khử khí 6: Đầu dò
3: Bơm cao áp 7: Hệ thống điều khiển, ghi nhận và xử lý tín hiệu 4: Bộ phận tiêm mẫu 8: In dữ liệu.
b) Phương pháp khối phổ:
Phương pháp khối phổ lượng là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (Atomic mass unit) hoặc bằng Dalton, 1 Amu bằng 1 Da và bằng khối lượng của nguyên tử hydro.
Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trước khi đến bộ phận phát hiện (decetor). Quá trình phân tích khối và phát hiện được thực hiện trong môi trường chân không (áp suất khoảng 10-5 đến 10-8 Torr).
Đối với các hợp chất hữu cơ: Cơ sở của phương pháp MS là sự ion hóa phân tử trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phá vỡ cấu trúc phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích (có khối lượng nhỏ hơn) bằng các phần tử mang năng lượng cao theo sơ đồ sau:
- Ion hóa phân tử trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích: M + e → M+ + 2e (> 95%)
→ M2+ + 3e → M-
25
- Phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích: ABCD + e* → ABn+ + C = Dm-
Sự phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích tuân theo định luật bảo toàn khối lượng. Năng lượng bắn phá (năng lượng ion hóa) là một yếu tố quyết định sự phân mảnh các hợp chất. Khi năng lượng bắn phá mẫu (khoảng 10 eV) bằng các năng lượng ion hóa phân tử sẽ gây nên sự ion hóa phân tử.
Nếu năng lượng ion hóa tăng lên (30 - 50 eV) sẽ bẻ gãy một số liên kết trong phân tử, tạo ra nhiều mảnh. Đó là các ion hoặc phân tử trung hòa có khối lượng bé hơn.
Quá trình phân mảnh đặc trưng cho cấu trúc của phân tử và chỉ ra sự có mặt của những nhóm chức đặc thù, cung cấp những thông tin hữu ích về cấu tạo hoặc nhận dạng các chất phân tích.
Một khối phổ kế bao gồm các bộ phận chính: Bộ phận nạp mẫu – đưa mẫu vào (inlet), bộ phân ion hóa (ion source), bộ phân tích khối (mass analyzer), bộ phát hiện ion (detector) và ghi/ xử lý số liệu (data system) (hình 1.7).
- Bộ phận nạp mẫu: Bộ phận nạp mẫu sẽ chuyển mẫu phân tích vào nguồn ion hóa của thiết bị khối phổ. Với LC-MS mẫu phân tích được nạp vào MS gián tiếp thông qua hệ thống HPLC.
- Nguồn ion hóa: Ion hóa phân tử trung hòa thành các ion mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phân tử mang năng lượng cao. Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân không của thiết bị MS. Các ion phân tử tạo thành sẽ được tăng tốc độ và thu gọn (hội tụ).
Việc tăng tốc được thực hiện bởi một điện thế (2-10 kV), khi ra khỏi buồng ion hóa các ion phân tử có tốc dộ đạt cao nhất. Việc thu gọn thành chùm ion được thực hiện bởi một điện trường phụ để khi vào phần phân tích khói là một dòng ion tập trung, đồng nhất.
26
Hình 1.7 Sơ đồ khối cấu tạo các bộ phận của một khối phổ kế
Có nhiều loại nguồn ion hóa sử dụng các kỹ thuật ion hóa khác nhau: + Kỹ thuật ion hóa va chạm điện tử (Electron Impact ionization). + Kỹ thuật ion hóa học (Chemical ioniation).
+ Kỹ thuật ion hóa điện trường (Field ionization).
+ Kỹ thuật bắn phá nhanh nguyên tử (Fast Atom Bombardment). + Kỹ thuật phản hấp thụ và ion hóa bằng tia laser.
+ Kỹ thuật ion hóa phun sương ddienj (ESI-Electron Spray Ionization). + Kỹ thuật ion hóa học ở áp suất khí quyển (APCI-Atmospheric pressure chemical ionization).
+ Kỹ thuật ion hóa ánh sáng ở áp suất khí quyển (APPI-Atmospheric pressure photoionization).
Trong số các kỹ thuật trên thì kỹ thuật ion hóa phun sương điện ESI được dùng phổ biến nhất trong các máy LC-MS. Trong ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích ở bề mặt. Khí và nhiệt ở xung quanh cung cấp nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương. Dung môi bay hơi làm gia tăng mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương. Khi mật độ điện tích này tăng đến điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh), lực đẩy lớn hơn sức căng bề mặt sẽ chia hạt sương thành những hạt nhỏ hơn. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ chứa các tiểu phân mang điện. Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí rồi đi vào bộ
Phân tích khối Ghi/ xử lý số liệu Đưa mẫu vào
Áp suất giảm (10-5 – 10-6 Torr)
Ion hóa Phân tích detector khối
27 phận phân tích khối.
- Bộ phận tách khối: Các ion hình thành ở nguồn ion hóa có khối lượng m và điện tích z ( tỷ số m/z được gọi là số khối) sẽ đi vào bộ phận phân tích khối. Bộ phận phân tích khối có nhiệm vụ tách các ion có số khối m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt nhờ các tác dụng của từ trường, điện trường trước khi đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu.
Có thể phân bộ phận phân tích khối thành 4 loại: Bộ phân tích từ, bộ phân tích tứ cực, bộ phân tích thời gian bay và bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotton. - Bộ phận phát hiện: Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận này cho phéo phát hiện và khuếch đại tín hiệu của các ion tương ứng về số lượng. Tín hiệu tạo ra sẽ được chuyển đến máy tính và thu được hệ thống dữ liệu dưới dạng phổ đồ.
Sắc ký lỏng khối phổ LC-MS là kỹ thuật phân tích tập hợp khả năng phân tách cao LC và khả phát hiện, định lượng chính xác của MS. Do đó được ứng dụng rộng rãi trong phân tích.
28