Phương pháp phân tích định lượng acetaminophen trê- 123docz.net

CHƯƠNG 2 .PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM

2.3. Thực nghiệm

2.3.1. Phương pháp phân tích định lượng acetaminophen trên LC-QTOF-

2.3.1.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký trên LC-QTOF-MS

Dựa trên cơ sở tham khảo nghiên cứu về xác định các chất ô nhiễm hữu cơ trong bụi không khí trên thiết bị LC-QTOF-MS của Kadokami [71], và có một số thay đổi nhỏ, đã chọn ra điều kiện như sau: thiết bị LC-QTOF-MS (Sciex X500R QTOF system), cột GL Science ODS-4 HP (chiều dài 150mm, đường kính trong 2,1mm và bề dày lớp pha tĩnh 3µm); pha động (pha động A: 5mM CH3COONH4

trong H2O, pha động B: 5 mM CH3COONH4 in CH3OH); thể tích tiêm mẫu là 2 µL; nhiệt độ cổng bơm 40°C, tốc độ dòng khí 0.3 mL min-1, nguồn ion TurbolonSpray, chế độ ion hoá ESI (+), chế độ đo Swath, TOF-MS (khoảng scan)50 - 1000 Da, 0.1s, TOF MS/MS50 - 1000 Da, 22 ranges, 0.07s each. Khí Nitơ được sử dụng làm khí mang.

2.3.1.2. Chuẩn bị mẫu chuẩn

Dung môi MeOH dùng làm mẫu trắng, pha dung dịch acetaminophen gốc (500 mg/L) (A) bằng cách cân chính xác 25 mg acetaminophen vào bình định mức 50 mL, hòa tan và định mức đến vạch bằng dung môi MeOH, bảo quản dung dịch chuẩn gốc ở -200C.

- Dung dịch chuẩn trung gian (1000 µg/L) (B): hút chính xác 0,2 ml dung dịch chuẩn gốc (A) vào bình định mức 100 mL, định mức bằng MeOH.

- Dung dịch chuẩn trung gian (10 µg/L) (C): hút chính xác 1 ml dung dịch (B) vào bình định mức 100 mL, định mức bằng MeOH.

- Dung dịch chuẩn làm việc (500 ng/L): hút chính xác 2,5 ml dung dịch (C) vào bình định mức 50 mL, định mức bằng MeOH, lọc qua màng lọc 0,45 µm

35 trước khi tiêm vào thiết bị đo.

2.3.1.3 Tính thích hợp của hệ thống

Tiến hành kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký, tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn (500 ng/L). Độ lệch chuẩn tương đối của kết quả đo acetaminophen giữa các lần tiêm lặp lại ≤ 2,0 %. Nếu kết quả cao hơn thì tiến hành thực hiện lại.

2.3.1.4. Giới hạn phát hiện (MDL) và giới hạn định lượng (LOQ)

Tiến hành phân tích mẫu chuẩn có hàm lượng acetaminophen thấp và tiến hành xác định tỷ lệ S/N. Giới hạn phát hiện (IDL) được xác định bằng cách pha loãng dần dung dịch chuẩn acetaminophen đến khi tỷ lệ tín hiệu thu được gấp khoảng 3 lần độ nhiễu đường nền (S/N).

Giới hạn phát hiện phương pháp (MDL) và giới hạn định lượng (LOQ) của acetaminophen sẽ được xác định dựa trên mối quan hệ giữa giới hạn phát hiện thiết bị (IDL) và giới hạn phát hiện phương pháp (MDL) và giới hạn định lượng (LOQ) theo tỷ lệ (IDL: MDL: LOQ = 1: 4: 10) (SMEWW 1030C, 2017) [71].

2.3.2. Xây dựng đường chuẩn và đảm bảo chất lượng của phương pháp

Để kiểm soát chất lượng của quy trình phân tích mẫu trên thiết bị LC- QTOF-MS-SWATH, quy trình kiểm soát chất lượng và đảm bảo chất lượng (QC/QA) thường được thực hiện. Trong nghiên cứu này, QA/QC được tiến hành theo hướng dẫn của SMEWW 1020A và 1020B (2017), bao gồm: quy trình vận hành tiêu chuẩn (SOP), phân tích thêm chuẩn đồng hành vào mẫu thử nghiệm, phân tích các mẫu lặp, xác nhận đường chuẩn và giới hạn phát hiện. Để xác định khả năng gây nhiễu và nhiễm bẩn trong quá trình phân tích và nhiễm bẩn từ phòng thí nghiệm, mẫu trắng được sử dụng để phân tích đồng thời với mỗi lô 8 mẫu. Nồng độ thực của các chất phát hiện được xác định sau khi đã trừ đi giá trị trung bình của mẫu trắng, mẫu lặp.

a) Xây dựng đường chuẩn

MeOH để xây dựng đường chuẩn. Các dung dịch chuẩn có nồng độ biến thiên trong khoảng 10 ppb – 1000ppb (0,1 ppb; 1 ppb; 10 ppb; 100 ppb; 1000 ppb). Tiêm các dung dịch này vào hệ thống sắc ký, ghi nhận kết quả. Xác định phương trình hồi quy giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic tín hiệu. Xác định giá trị hệ số tương quan R2.

Xác định các giá trị đo được y theo nồng độ x (lặp lại 3 lần lấy giá trị trung bình). Nếu sự phụ thuộc tuyến tính, ta có khoảng khảo sát đường biểu diễn là một phương trình: y = ax + b

Trong đó: a: giá trị slope (độ dốc)

b: giá trị intercept (hệ số chặn) Và hệ số tương quan R: Rx,y = ∑

𝑛

𝑖=1 (𝑥𝑖 −𝑋 )(𝑦𝑖 − 𝑌 )

√∑𝑛𝑖=0 (𝑥𝑖 − 𝑋 )2∑𝑛𝑖=0 (𝑦𝑖− 𝑌)2 (2.13) - Yêu cầu độ tuyến tính của đường chuẩn: 1> R2 ≥ 0,9

- Kiểm tra lại một điểm giữa của dãy chuẩn, yêu cầu sai số cho phép ≤ 15% - Nếu không đạt điều kiện trên, tiến hành kiểm tra và dựng lại đường chuẩn. Khoảng xác định được suy ra từ kết quả độ đúng và độ tuyến tính (Từ giá trị nhỏ nhất đến giá trị lớn nhất của độ đúng).

b) Phân tích mẫu trắng

- Tiến hành phân tích mẫu trắng (là dung môi MeOH) vào mỗi lần phân tích mẫu thử.

- Nồng độ của chỉ tiêu phân tích tìm thấy trong mẫu trắng phải nhỏ hơn giới hạn phát hiện của phương pháp.

- Nếu nồng độ của mẫu trắng cao, thì phải kiểm tra mẫu trắng và tiến hành phân tích lại.

c) Đo lặp lại

- Nếu độ lệch chuẩn của các giá trị thu được nằm ngoài giới hạn trên, thì phải tiến hành phân tích lại.

d) Mẫu kiểm soát của phòng thí nghiệm

- Mẫu kiểm soát được tiến hành phân tích theo quy trình vận hành chuẩn. - Cứ mỗi 10 mẫu, thì phân tích mẫu kiểm soát, hoặc trước khi kết thúc đo mẫu thì đo mẫu kiểm soát.

- Độ thu hồi của mẫu kiểm soát tối đa là 60-125% - Nếu không đạt, thì tiến hành kiểm tra và phân tích lại

2.3.3. Phương pháp chiết tách mẫu

2.3.3.1. Phương pháp chiết tách

Phương pháp chiết tách acetaminophen trong mẫu bụi không khí trong nhà được thực hiện dựa trên phương pháp phân tích các thuốc diệt côn trùng trong mẫu bụi không khí xung quanh, đã được công bố bởi nhóm tác giả Duong và Kadokami [73]. Với nội dung cụ thể như sau:

- Chuẩn bị mẫu với khối lượng 1g và cho vào ống ly tâm màu nâu thể tích 50ml, bơm 50 µL chuẩn đồng hành (nồng độ 4 µg/mL) vào mẫu.

- Sau đó mẫu được chiết siêu âm với 20mL MeOH sử dụng thiết bị siêu âm trong thời gian 20 phút. Ly tâm 10 phút với tốc độ 2000 vòng/phút. Quá trình chiết tách được lặp lại 02 lần (15 mL MeOH/lần).

- Dịch chiết thu được sau 3 lần chiết được gộp lại và cô quay chân không đến 1 mL, sau đó cô đặc bằng thổi khí nitơ đến khi thể tích còn khoảng 0,2 mL. Thêm 50 µL nội chuẩn (4 µg/mL) vào dịch chiết và định mức đến 0,5 mL bằng MeOH. Dịch chiết cuối cùng được lọc bằng bộ lọc ống tiêm (Millex –LG, 4 mm, Merck Millipore, Darmastadt, Đức), sau đó phân tích trên thiết bị LC-QTOF-MS theo quy trình đã khảo sát.

2.3.3.2. Xác định hiệu suất thu hồi của phương pháp chiết tách

suất của quá trình chiết tách và phân tích. Chất chuẩn đồng hành acetaminophen –d4 được bơm vào mẫu bụi trước khi chiết tách.

Tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng mẫu bụi không khí trong nhà thêm 50 µL chất chuẩn đồng hành nồng độ 4 µg/mL. Phân tích các mẫu thêm đó (mỗi mức làm lặp lại tối thiểu 6 lần). Tính hiệu suất thu hồi đối với mẫu theo công thức:

H% = ∁𝑡𝑡

∁𝐶 ×100 (2.14) Trong đó: H%: hiệu suất thu hồi

Ctt: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn Cc: Nồng độ thêm chuẩn (lý thuyết)

Sau đó tính hiệu suất thu hồi chung là trung bình của hiệu suất thu hồi các lần làm lặp lại.

+ Thêm chuẩn ở ba mức nồng độ là mức thấp, trung bình và cao trong khoảng nồng độ làm việc. Theo quy định của hội đồng Châu Âu đối với các chỉ tiêu an toàn (các chỉ tiêu thuộc nhóm độc, có quy định giới hạn cho phép) thêm chuẩn vào mẫu trắng ở ba mức nồng độ 0,5 lần, 1 lần, 2 lần giới hạn cho phép (MRL).

+ Yêu cầu: Độ lệch chuẩn tương đối tương đối (RSD %) tính theo diện tích peak sắc ký của 03 lần thực hiên riêng biệt trên cùng một nồng độ phải nhỏ hơn 10%.

+ Độ thu hồi của mẫu kiểm soát tối đa là 70% - 125%. + Nếu không đạt thì tiến hành kiểm tra và phân tích lại.

+ Nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu được tính theo công thức chung như sau: ∁ = 𝑥0× 𝑙

𝑚,(𝑉) (2.14) Trong đó:

X: Nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu µg/kg hoặc µg/L C0: Nồng độ chất cần phân tích tính từ đường chuẩn, µg/L l: Thể tích định mức, mL

2.3.4. Thu thập và phân tích mẫu bụi tại Hà nội

Mẫu bụi không khí trong nhà được lấy từ 6 quận tại Hà Nội: Long Biên (3 mẫu), Hoàn Kiếm (3 mẫu), Cầu Giấy (1 mẫu), Ba Đình (1 mẫu), Từ Liêm (1 mẫu) và Thanh Xuân (1 mẫu).

Phương pháp lấy mẫu bụi không khí trong nhà được tham khảo theo các nghiên cứu đã được công bố trước đây của Duong et al. (2019). Các mẫu bụi trong nhà được lấy trong phòng khách từ bề mặt của đồ nội thất: gầm bàn, ghế sofa, trên nóc tủ, tủ lạnh, máy điều hòa không khí và cánh quạt của máy hút bụi được gắn với nylon bên trong vòi phun. Phần bụi này được hình thành chủ yếu do sự tích tụ các hạt mịn trong không khí trong nhà theo thời gian và có thể là đại diện cho loại bụi mà con người hít thở vào. Các mẫu riêng lẻ được gói trong giấy nhôm và cho vào trong túi zip polyetylen để bảo quản khỏi độ ẩm, ánh sáng và các yếu tố bên ngoài khác có thể làm thay đổi thành phần của mẫu. Mẫu bụi được rây qua rây 250 µm và được bảo quản ở -20°C cho đến khi phân tích. Các mẫu bụi được chiết tách và phân tích theo quy trình phân tích đã khảo sát ở trên.

Mẫu bụi trước khi xử lý sơ bộ Mẫu bụi sau khi xử lý

Hình 2.2: Mẫu bụi trong nhà để phân tích

Kết quả phân tích được xử lý và phân tích thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel (Microsoft office, 2010) và Minitab 16® Statistical Software (Minitab Inc.). Nồng độ các hợp chất không được phát hiện được coi là không.

2.3.5. Phương pháp đánh giá rủi ro

Đánh giá độc tính của acetaminophen thông qua chỉ số: Liều lượng phơi nhiễm hàng ngày: IDi (ng/kg bw/d); chỉ số nguy hại: HQ (Hazard Quotient). Giá trị HQ >1 phản ánh mức độ rủi ro tiềm ẩn của acetaminophen đối với sức khỏe con người.

khí qua đường hô hấp được tính toán sử dụng công thức sau [65]:

𝐼𝐷𝑖 = 𝐶𝑖×𝐹𝑇×𝐼𝑅×𝐴𝐹

𝐵𝑊 ( 2.15 )

Trong đó: Ci: nồng độ của acetaminophen trong bụi không khí, (ng/g); FT: thời gian ở trong nhà (giờ);

IR: tốc độ hít thở;

BW: trọng lượng cơ thể (kg);

AF: là khả năng hấp thụ acetaminophen trong cơ thể con người.

Hai nhóm đối tượng (người lớn và trẻ em) được tính toán phơi nhiễm acetaminophen ở nồng độ acetaminophen trung bình được phát hiện trong các mẫu bụi không khí trong nhà.

Thời gian phơi nhiễm được tính trong 24 giờ. Tỷ lệ hít thở đối với người lớn được ước tính là 16 m3 ngày-1 và 10,1 m3 ngày-1 đối với trẻ em. Trọng lượng cơ thể trung bình cho người lớn và trẻ em Việt Nam lần lượt là 60 kg và 15 kg.

- Chỉ số nguy hại (Hazard Quotient - HQ): sử dụng để đánh giá tác hại của acetaminophen đối với sức khỏe con người, HQi được tính theo công thức sau [64]:

𝐻𝑄𝑖 = 𝐼𝐷𝑖

𝑅𝑓𝐷𝑖 ( 2.2)

Trong đó: RfDi: Là liều tham chiếu tương ứng của hóa chất i (ng/kg bw/d). + Nếu giá trị HQ≤1 phản ánh mức độ rủi ro tiềm ẩn của acetaminophen có thể chấp nhận được.

+ Nếu giá trị HQ>1 cho thấy sự tích lũy hàng ngày của acetaminophen sẽ có khả năng gây ra các ảnh hưởng xấu đối với sức khỏe con người [74].

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả điều kiện phân tích và đường chuẩn của acetaminophen trên thiết bị LC-QTOF-MS

3.1.1. Kết quả điều kiện phân tích acetaminophen

Hợp chất acetaminophen được phân tích trên thiết bị LC-QTOF-MS (Sciex X500R QTOF system), cột GL Science ODS-4 HP (chiều dài 150mm, đường kính trong 2,1mm và bề dày lớp pha tĩnh 3µm); pha động (pha động A: 5mM CH3COONH4 trong H2O, pha động B: 5 mM CH3COONH4 trong CH3OH). Gradient pha động được duy trì 5 % (B) trong 30 phút và sau đó tăng tuyến tính lên 95 % (B) trong 20 phút. Thời gian chạy bao gồm cả việc cân bằng lại cột về điều kiện ban đầu là 60 phút. Thể tích tiêm mẫu là 2 µL, tốc độ dòng khí 0.3 mL min-1, nhiệt độ cổng bơm 40°C, nguồn ion TurbolonSpray, chế độ ion hoá ESI (+), chế độ đo Swath, TOF-MS (khoảng scan)50 - 1000 Da, 0.1s, TOF MS/MS50 - 1000 Da, 22 ranges, 0.07s each. Khí Nitơ được sử dụng làm khí mang. Các ion mẹ, ion con và thời gian lưu của acetaminophen là 6,402 phút được xác định và chỉ ra ở bảng 3.1 và hình 3.1.

Bảng 3.1 Ion định lượng, ion xác nhận của từng chất và các thông số tối ưu cho acetaminophen Chất Precursor (m/z) Product ion1 (m/z) Product ion2 (m/z) Collision Energy Cone (V) CE (eV) Thời gian lưu (phút) Acetaminophen 152,1 110,1 93 30 5 5 6,402

Bảng 3.2 Các điều kiện LC-QTOF-MS

Thiết bị Sciex X500R QTOF

Cột GL Science ODS-4 HP (150 mm, 2.1 mm, 3 µm) Nhiệt độ cổng bơm 40 °C Tốc độ dòng khí 0.3 mL min-1 Pha động A: 5 mM CH3COONH4.H2O B: 5 mM CH3COONH4.CH3OH Chương trình chạy Thời gian, phút 0 30 - 40 40.01 - 50 B, % 5 95 5 Thể tích bơm mẫu 2 mL

Nguồn ion TurbolonSpray

Chế độ ion hóa ESI (+)

Chế độ đo Swath

TOF-MS (khoảng scan) 50 - 1000 Da, 0.1s

TOF MS/MS 50 - 1000 Da, 22 ranges, 0.07s each

Năng lượng va chạm 20 – 50 V

Độ phân giải 30000

(a) (b)

(c)

Hình 3.1 Phổ khối, thời gian lưu acetaminophen

3.1.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn cho acetaminophen trên LC-QTOF-MS

Sử dụng điều kiện vừa được xác định ở trên để xây dựng đường chuẩn cho phép định lượng acetaminophen với khoảng nồng độ: từ 10 ppb – 1000ppb (0,1 ppb; 1 ppb; 10 ppb; 100 ppb; 1000 ppb) trong MeOH.

Từ các kết quả đường chuẩn của acetaminophen (hình 3.2): y = 0,004664 x + 0,00334 với R= 0,90899; R2 = 0,908801

Hình 3.2 Đường chuẩn acetaminophen

3.1.3. Giới hạn phát hiện xác định (MDL) và giới hạn định lượng LOQ của acetaminophen LC-QTOF-MS acetaminophen LC-QTOF-MS

Từ thực nghiệm xác định được giới hạn phát hiện của thiết bị IDL là 0,2 gp. Giới hạn phát hiện phương pháp (MDL) và giới hạn định lượng (LOQ) của mỗi chất được xác định dựa trên mối quan hệ của chúng với giới hạn phát hiện thiết bị (IDL) và MDL và LOQ theo tỷ lệ (IDL: MDL: LOQ = 1: 4: 10) (SMEWW 1030C, 2017).

Các MDL và LOQ được tính theo IDL được chỉ ra ở bảng 3.3.

Bảng 3.3: Các thông số tính toán MDL và LOQ

Thông số Acetaminophen

IDL (pg) 0,2

MDL (ng/ g) 1

LOQ (ng/ g) 20

3.2. Kết quả kiểm soát chất lượng quy trình phân tích và hiệu suất thu hồi imidacloprid và thiamethoxam trên thiết bị LC-QTOF-MS-SWATH imidacloprid và thiamethoxam trên thiết bị LC-QTOF-MS-SWATH

Kết quả phân tích mẫu trắng cho thấy không có sự nhiễm bẩn của acetaminophen. Đểđánh giá hiệu suất của quá trình chiết tách tiến hành phân tích trên 10 mẫu bụi trong nhà sau đó bổ sung chuẩn đồng hành acetaminophen-d4. Kết quả thu được là hiệu suất thu hồi dao động trong khoảng từ 84 -98% độ lệch chuẩn RSD 4,7%, đối chiếu với yêu cầu về độ thu hồi và độ lệch chuẩn tại bảng

F của AOAC thì độ thu hồi phải đạt từ 40%-120%, độ lệch chuẩn nhỏ hơn 15% (phụ lục). Do đó quy trình phân tích đạt tiêu chuẩn yêu cầu để phân tích acetaminophen trong mẫu bụi không khí trong nhà.

Bảng 3.3 Hiệu suất thu hồi của chất chuẩn đồng hành acetaminophen-d4 trong 10 mẫu bụi trong nhà

Mẫu Hiệu suất thu hồi (%) acetaminophen-d4 Mẫu 1 83,8 Mẫu 2 99,1 Mẫu 3 88,0 Mẫu 4 92,8 Mẫu 5 98,2 Mẫu 6 89,7 Mẫu 7 95,7 Mẫu 8 89,2 Mẫu 9 87,7 Mẫu 10 89,2 Trung bình 91,8 Độ lệch chuẩn, RSD (%) 4,7

Quy trình chiết tách và phân tích acetaminophen trong mẫu bụi không khí trong nhà được tóm tắt như sau:

Hình 3.3 Quy trình chiết tách acetaminophen trong mẫu bụi

Quy trình chiết tách: Cân 1 g mẫu bụi cho vào ống ly tâm màu nâu thể tích Mẫu bụi

Phân tích trên LC-QTOF-MS