Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng tách vật lý của sắc ký lỏng với khả năng phân tích khối lượng của phép đo phổ khối (MS). Sắc ký lỏng là một kỹ thuật tách và phép đo phổ khối được sử dụng để phân tích tỷ lệ khối lượng điện – điện tích của các hạt tích điện. Sự phân tách vật lý thường đạt được bằng HPCL và cách khác. LC- MS còn được gọi là HPLC-MS.
LC-MS là một kỹ thuật đầy tiềm năng được ứng dụng ngày càng rộng rãi vì có tính chọn lọc và độ nhạy cao, giới hạn phát hiện có thể đến 10 -14 gam, thời gian phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu gần giống nhau mà các phương pháp sắc ký lỏng thông thường không làm được.
a) Hệ thống HPLC
HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữu hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thành phần pha động đưa chất phân tích qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất phân tích với thời gian hợp lý.
Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm có các bộ phận cơ bản như sau (Hình 1.6):
24
Hình 1.6. Sơ đồ hệ thống HPLC
Trong đó:
1: Bình chứa pha động 5: Cột sắc ký (pha tĩnh) 2: Bộ phận khử khí 6: Đầu dò
3: Bơm cao áp 7: Hệ thống điều khiển, ghi nhận và xử lý tín hiệu 4: Bộ phận tiêm mẫu 8: In dữ liệu.
b) Phương pháp khối phổ:
Phương pháp khối phổ lượng là một kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích của ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu. Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử (Atomic mass unit) hoặc bằng Dalton, 1 Amu bằng 1 Da và bằng khối lượng của nguyên tử hydro.
Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phận phân tích khối trước khi đến bộ phận phát hiện (decetor). Quá trình phân tích khối và phát hiện được thực hiện trong môi trường chân không (áp suất khoảng 10-5 đến 10-8 Torr).
Đối với các hợp chất hữu cơ: Cơ sở của phương pháp MS là sự ion hóa phân tử trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích hoặc sự bắn phá, phá vỡ cấu trúc phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích (có khối lượng nhỏ hơn) bằng các phần tử mang năng lượng cao theo sơ đồ sau:
- Ion hóa phân tử trung hòa thành các ion phân tử mang điện tích: M + e → M+ + 2e (> 95%)
→ M2+ + 3e → M-
25
- Phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích: ABCD + e* → ABn+ + C = Dm-
Sự phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích tuân theo định luật bảo toàn khối lượng. Năng lượng bắn phá (năng lượng ion hóa) là một yếu tố quyết định sự phân mảnh các hợp chất. Khi năng lượng bắn phá mẫu (khoảng 10 eV) bằng các năng lượng ion hóa phân tử sẽ gây nên sự ion hóa phân tử.
Nếu năng lượng ion hóa tăng lên (30 - 50 eV) sẽ bẻ gãy một số liên kết trong phân tử, tạo ra nhiều mảnh. Đó là các ion hoặc phân tử trung hòa có khối lượng bé hơn.
Quá trình phân mảnh đặc trưng cho cấu trúc của phân tử và chỉ ra sự có mặt của những nhóm chức đặc thù, cung cấp những thông tin hữu ích về cấu tạo hoặc nhận dạng các chất phân tích.
Một khối phổ kế bao gồm các bộ phận chính: Bộ phận nạp mẫu – đưa mẫu vào (inlet), bộ phân ion hóa (ion source), bộ phân tích khối (mass analyzer), bộ phát hiện ion (detector) và ghi/ xử lý số liệu (data system) (hình 1.7).
- Bộ phận nạp mẫu: Bộ phận nạp mẫu sẽ chuyển mẫu phân tích vào nguồn ion hóa của thiết bị khối phổ. Với LC-MS mẫu phân tích được nạp vào MS gián tiếp thông qua hệ thống HPLC.
- Nguồn ion hóa: Ion hóa phân tử trung hòa thành các ion mang điện tích hoặc sự bắn phá, phân mảnh phân tử trung hòa thành các mảnh ion, các gốc mang điện tích bằng các phân tử mang năng lượng cao. Những tiểu phân không bị ion hóa sẽ bị hút ra khỏi buồng ion qua bơm chân không của thiết bị MS. Các ion phân tử tạo thành sẽ được tăng tốc độ và thu gọn (hội tụ).
Việc tăng tốc được thực hiện bởi một điện thế (2-10 kV), khi ra khỏi buồng ion hóa các ion phân tử có tốc dộ đạt cao nhất. Việc thu gọn thành chùm ion được thực hiện bởi một điện trường phụ để khi vào phần phân tích khói là một dòng ion tập trung, đồng nhất.
26
Hình 1.7 Sơ đồ khối cấu tạo các bộ phận của một khối phổ kế
Có nhiều loại nguồn ion hóa sử dụng các kỹ thuật ion hóa khác nhau: + Kỹ thuật ion hóa va chạm điện tử (Electron Impact ionization). + Kỹ thuật ion hóa học (Chemical ioniation).
+ Kỹ thuật ion hóa điện trường (Field ionization).
+ Kỹ thuật bắn phá nhanh nguyên tử (Fast Atom Bombardment). + Kỹ thuật phản hấp thụ và ion hóa bằng tia laser.
+ Kỹ thuật ion hóa phun sương ddienj (ESI-Electron Spray Ionization). + Kỹ thuật ion hóa học ở áp suất khí quyển (APCI-Atmospheric pressure chemical ionization).
+ Kỹ thuật ion hóa ánh sáng ở áp suất khí quyển (APPI-Atmospheric pressure photoionization).
Trong số các kỹ thuật trên thì kỹ thuật ion hóa phun sương điện ESI được dùng phổ biến nhất trong các máy LC-MS. Trong ESI, tại đầu ống dẫn mao quản, dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành những hạt sương nhỏ mang điện tích ở bề mặt. Khí và nhiệt ở xung quanh cung cấp nhiệt năng làm bay hơi dung môi ra khỏi giọt sương. Dung môi bay hơi làm gia tăng mật độ điện tích tại bề mặt hạt sương. Khi mật độ điện tích này tăng đến điểm giới hạn (giới hạn ổn định Rayleigh), lực đẩy lớn hơn sức căng bề mặt sẽ chia hạt sương thành những hạt nhỏ hơn. Quá trình này được lặp lại nhiều lần để hình thành những hạt rất nhỏ chứa các tiểu phân mang điện. Từ những hạt rất nhỏ mang điện tích này, các ion phân tích được chuyển thành thể khí rồi đi vào bộ
Phân tích khối Ghi/ xử lý số liệu Đưa mẫu vào
Áp suất giảm (10-5 – 10-6 Torr)
Ion hóa Phân tích detector khối
27 phận phân tích khối.
- Bộ phận tách khối: Các ion hình thành ở nguồn ion hóa có khối lượng m và điện tích z ( tỷ số m/z được gọi là số khối) sẽ đi vào bộ phận phân tích khối. Bộ phận phân tích khối có nhiệm vụ tách các ion có số khối m/z khác nhau thành từng phần riêng biệt nhờ các tác dụng của từ trường, điện trường trước khi đến bộ phận phát hiện và xử lý số liệu.
Có thể phân bộ phận phân tích khối thành 4 loại: Bộ phân tích từ, bộ phân tích tứ cực, bộ phân tích thời gian bay và bộ phân tích cộng hưởng ion cyclotton. - Bộ phận phát hiện: Sau khi đi ra khỏi bộ phận phân tích khối, các ion được đưa tới phần cuối của thiết bị khối phổ là bộ phận phát hiện ion. Bộ phận này cho phéo phát hiện và khuếch đại tín hiệu của các ion tương ứng về số lượng. Tín hiệu tạo ra sẽ được chuyển đến máy tính và thu được hệ thống dữ liệu dưới dạng phổ đồ.
Sắc ký lỏng khối phổ LC-MS là kỹ thuật phân tích tập hợp khả năng phân tách cao LC và khả phát hiện, định lượng chính xác của MS. Do đó được ứng dụng rộng rãi trong phân tích.
28
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1. Hóa chất
- Dung môi: Methanol, n –hexan (Hex), aceton (Ace) , etyl axetat (EtAc) đều thuộc loại tinh khiết dùng cho HPCL và LC- MS của công ty hóa chất Kanto Chemical (Tokyo, Nhật Bản).
- Dung dịch chuẩn gốc: Chất chuẩn gốc acetaminophen (CAS số 103-90- 2) có nồng độ ≥ 99% được mua từ Restek Japan và được pha loãng với methanol để chuẩn bị các dung dịch hỗn hợp hoạt động và sau đó được bảo quản ở -20°C trong tủ đông.
- Hỗn hợp nội chuẩn (IS) và chuẩn đồng hành: Được mua từ Kanto Chemical và Hayashi Pure Chemical (Osaka, Japan). Nội chuẩn: methomyl-d3, chuẩn đồng hành: acetaminophen –d4.
- Methanol (độ tinh khiết cấp LC-MS) và amino axetat (CAS:631-61-8; nồng độ 1 mol/L, độ tinh khiết cấp HPLC) được sản xuất lần lượt từ Kanto Chemical và Fujifilm Wako Pure Chemical corporation (Osaka, Japan ).
- Nước máy tinh khiết (cấp LC-MS) bằng Elga Purelab Chorus 1 (Nghiên cứu phân tích; Veolia Water, Tokyo, Japan).
- Bộ lọc ống tiêm Millex-LG (kích thước lỗ 0,2 µm, Ø4 mm) của Merk Millipore (Darmstadt, Gemany).
- Màng lọc: sợi thạch anh (QR-100; 203 x 254 mm) của hãng Advantec. - Dụng cụ thủy tinh: Được làm sạch bằng cách ngâm nước tẩy rửa axit cromic (bao gồm 5% Kali đicromat trong dung dịch H2SO4). Sau tráng rửa dụng cụ cẩn thận bằng nước khử ion và axeton, dụng cụ thủy tinh được sấy khô ở 250°C trong 5 giờ trước khi mang ra sử dụng.
2.1.2. Thiết bị
29
- Thiết bị sắc ký lỏng khối phổ (LC-QTOF-MS) của hãng SCIEX. - Thiết bị cô cất quay chân không (Buchi Rotavapor® R-215) - Bể siêu âm (SUPER RK510)
- Thiết bị ly tâm (Hettich Rotina 420R, Đức) - Cân phân tích (±0.0001 mg)
- Lò nung (50oC - 700oC) với bộ điều khiển nhiệt (Carbolite oven, Đức) - Tủ sấy (50oC - 300oC) (Sellab, Mỹ)
- Tủ lạnh sâu (Sanyo Biomedical MDF-U333)
- Thiết bị cất nước tinh khiết (Elix 3 UV Water Purification System (120 V/60 Hz, Millipore)
Hình 2.1: Hệ thống thiết bị LC-QTOP-MS (SCIEX X500R QTOF) 2.2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu
- Đối tượng nghiên cứu: Acetaminophen trong mẫu bụi không khí trong nhà. - Phạm vi nghiên cứu: Thành phố Hà Nội.
- Thời gian lấy mẫu: tháng 6/2018. - Nội dung thực hiện qua các bước:
+ Bước 1: Khảo sát quy trình phân tích xác định hàm lượng acetaminophen trong mẫu bụi trên thiết bị LC-MS.
30
+ Bước 2: Lấy mẫu tại các vị trí khảo sát xung quanh Thành Phố Hà Nội. + Bước 3: Tiến hành phân tích mẫu thực tế sử dụng kỹ thuật chiết tách và phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) để phân tích xác định hàm lượng acetaminophen.
+ Bước 4: Đánh giá rủi ro, tác động của acetaminophen trong bụi không khí trong nhà đến sức khỏe con người.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2.1. Phương pháp thu thập số liệu
Phương pháp thu thập, kế thừa số liệu, dữ liệu từ các tài liệu trong nước và quốc tế liên quan đến hiện trạng hoá chất acetaminophen trong không khí và bụi không khí. Tham khảo các phương pháp thu thập mẫu, chiết tách, phân tích mẫu, tổng hợp số liệu điều tra, khảo sát và phân tích kết quả. Các phương pháp đánh giá độc tính và truy tìm nguồn ô nhiễm.
2.2.2.2. Phương pháp điều tra thực địa
Phương pháp nghiên cứu thực địa nhằm khảo sát và lựa chọn được vị trí lấy mẫu phù hợp (đảm bảo các yêu cầu về mật độ dân cư, loại hình sản xuất, kinh doanh trong khu vực...).
2.2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu
Sử dụng phần mềm trợ giúp Microsoft Excel Professional Plus 2013. Phương pháp xử lý số liệu thống kê được dùng để đánh giá độ lặp, độ tin cậy của phép đo. Một số đại lượng thống kê sử dụng trong xử lý số liệu:
- Giá trị trung bình :
(2.1) - Độ lệch chuẩnS của phép đo (SD):
31
- Độ lệch chuẩn tương đối (relative standard deviation) Sr (2.3)
- Giới hạn phát hiện (LOD):
(2.4)
Cmin: Nồng độ nhỏ nhất mà chiều cao tín hiệu pic của chất phân tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền. S/N: Tín hiệu nền
- Giới hạn định lượng (LOQ) :
(2.5)
- Độ chính xác của phép đo: Theo ISO, độ chính xác của phép đo được đánh giá qua độ đúng và độ chụm. Độ chụm là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của các phép đo lặp lại. Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị phân tích với giá trị thực. Độ đúng được biểu diễn dưới dạng sai số tuyệt đối hoặc sai số tương đối. Sai số được tính theo công thức:
(2.6)
(2.7) Trong đó: %X: Sai số phần trăm tương đối. Si : giá trị đo được tại mỗi lần đo i.
St : giá trị tìm được theo lý thuyết (đường chuẩn). n: số lần đo.
- Độ lặp lại của phép đo: Được xác định theo các đại lượng S2, CV.
32
Trong đó: Stb: Nồng độ trung bình, n: số lần đo, S: độ lệch chuẩn - CV: hệ số biến động của phép đo.
- Khoảng tin cậy:
hay (2.10)
Với cơ số mẫu bé, σ chính là S hoặc SRD. Trong nghiên cứu này với xác suất tin cậy là 96%, tương ứng với Z = 2 (quy tắc 2σ) được sử dụng để đánh giá độ tin cậy của phép đo.
2.2.2.4. Đánh giá mức độ rủi ro
Nồng độ acetaminophen dưới giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL) và dưới giới hạn định lượng (LOQ) coi là giá trị 0 để phân tích dữ liệu.
Trong nghiên cứu này đã đánh giá mức độ phơi nhiễm khi ăn phải acetaminophen trong bụi nhà đối với sức khoẻ con người bao gồm vả người lớn và trẻ em ở Hà Nội. Liều lượng hấp thụ hàng ngày ID của acetaminophen do ăn phải bụi và việc đo lường tác động có hại có thể xảy ra của một cá nhân liên quan đến sức khoẻ con người. Chỉ số nguy hiểm (HQ) được ước tính theo phương trình như sau [65,66]. 𝐼𝐷𝑖 = 𝐶𝑖×𝐼𝑅×𝐹𝑇 ×𝐴𝐹 𝐵𝑊 (2.11) 𝐻𝑄 = 𝐼𝐷𝑖 𝑅𝑓𝐷𝑖 (2.12) Trong đó:
C là nồng độ Σ 10 acetaminophen trong bụi ở các địa điểm nghiên cứu; FT là tỉ lệ phần trăm thời gian ở tại nhà;
IR và AF là tốc độ trung bình hít bụi và khả năng hấp thụ acetaminophen trong cơ thể người.
BW là trọng lượng trung bình của cơ thể.
Chỉ số FT trong nghiên cứu này được giả định lần lượt là 86% và 64% đối với trẻ em và người lớn [67].
33
Trong nghiên cứu này, liều tham chiếu chế độ ăn uống mãn tính (cRfD) và liều tham chiếu chế độ ăn uống cấp tính (aRfD) do USHHS cung cấp được sử dụng là liều tham chiếu khi ăn phải bụi nhà [68,69]. Ngoài ra cả nồng độ hấp thụ được sử dụng trong hai trường hợp là tỷ lệ hấp thụ trung bình (tương ứng là 20 mg/ ngày và 50 mg/ ngày đối với người lớn và trẻ em) và tỷ lệ hấp thụ cao (50 mg/ ngày và 200 mg/ ngày tương ứng với trẻ em và người lớn) [70]. Cân nặng trung bình của người lớn và trẻ em được giả định lầm lượt là 60 kg và 18 kg.
2.2.2.5. Các bước thực hiện khi phân tích trên thiết bị LC-QTOF-MS.
❖ Bước 1: Chuẩn bị pha động Bước 2: Chuẩn bị chất chuẩn
- Quy trình chuẩn bị chuẩn (standards) theo quy trình của từng ứng dụng. ❖ Bước 3: Chuẩn bị hệ thống LC
- Bật các thiết bị của LC (Autosampler, pump 1, pump 2, oven, CBM). - Chuẩn bị pha động, dung dịch rửa cho kim tiêm, dung dịch rửa pump. - Điền đầy đủ đường ống bằng pha động mới bằng cách xoay vavle của pump 1 và pump 2 trên pump (xoay núm 1 vòng nhấn purge. Có thể nhấn thêm purge 1 lần nữa nếu thấy 1 lần purge chưa đủ). Sau khi purge xong, khóa chặt vavle lại.
- Purge đường nước rửa cho autosampler. - Lắp cột phân tích vào lò cột (nếu chưa lắp).
- Nếu cột mới, cần phải cân bằng cột trong thời gian từ 2 - 3 giờ với tốc độ dòng khoảng 0,2 - 0,3 mL/ min của MeOH : H2O (tỷ lệ 60: 40) (khi cân bằng cột, đầu ra của cột tháo khỏi detector MS, cho vào một lọ thải, tránh làm bẩn detector). - Nếu cột cũ đang sử dụng, cân bằng cột trong thời gian 30 min với pha động như trên (dung môi cho pha động lựa chọn tùy thuộc loại mẫu phân tích).
- Kiểm tra mực nước thải trong chai thải, đổ đi nếu đầy . - Mở máy tính .
34
- Thiết bị LC sẵn sàng cho quá trình phân tích. ❖ Bước 4: Tạo phương pháp phân tích/Acquisition.