CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.4.4. Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự gen
Đoạn gen khuếch đại cĩ kích thước xấp xỉ 900 bp được tinh sạch bằng kit GeneJET Gel Extraction Kit của ThermoScientific (Mỹ). Các bước thực hiện cụ thể như sau:
Bước 1: Loại bỏ phần gel cĩ chứa đoạn DNA bằng dao mổ hoặc lưỡi dao
cạo sạch. Cắt càng gần DNA càng tốt để giảm thiểu thể tích gel. Đặt lát gel vào ống 1,5 mL đã được cân trước và sau khi cho lát gel. Ghi lại khối lượng của lát gel.
Bước 2: Thêm một lượng thể tích đệm liên kết (Binding buffer) vào lát gel
với tỉ lệ 1: 1.
Bước 3: Ủ hỗn hợp gel ở 50-60°C trong 10 phút hoặc cho đến khi miếng
gel được hịa tan hồn tồn. Trộn ống bằng cách đảo ngược vài phút một lần để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình nấu chảy. Đảm bảo rằng gel được hịa tan hồn tồn. Lắc xốy nhẹ hỗn hợp gel trước khi cho lên cột.
Kiểm tra màu sắc của dung dịch. Màu vàng cho biết độ pH tối ưu để liên kết DNA. Nếu màu của dung dịch là cam hoặc tím, thêm 10 µL natri acetat 3 M, dung dịch pH 5,2 và trộn. Màu của hỗn hợp sẽ trở thành màu vàng.
Bước 4: Chuyển tối đa 800µL dung dịch gel hịa tan (từ bước 3 hoặc 4) vào
cột tinh chế GeneJET. Ly tâm trong 1 phút. Loại bỏ phần dịng chảy qua cột và đặt cột trở lại vào cùng ống thu gom.
Bước 5: Thêm 100µL đệm liên kết (Binding buffer) vào cột lọc GeneJET.
Ly tâm 13000rpm trong 1 phút. Loại bỏ dịng chảy qua và đặt cột trở lại vào cùng ống thu gom.
Bước 6: Thêm 700µL đệm rửa (pha lỗng với ethanol như mơ tả trên trang
3) vào cột tinh chế GeneJET. Ly tâm 13000rpm trong 1 phút. Loại bỏ dịng chảy qua cột và đặt cột trở lại vào ống eppendorf.
Bước 7: Ly tâm 13000rpm cột lọc GeneJET rỗng thêm 1 phút để loại bỏ
hồn tồn dung dịch đệm rửa cịn sĩt lại.
Bước 8: Chuyển cột lọc GeneJET vào ống ly tâm siêu nhỏ 1,5mL sạch (khơng bao gồm). Thêm 50µL đệm rửa giải vào tâm của màng cột tinh chế. Ly tâm 13000rpm trong 1 phút.
Sản phẩm đã tinh sạch được xác định trình tự theo phương pháp Sanger [128] trên hệ máy ABI3100 (Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam).