Bảng 3. 4. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các mẫu nghiên cứu
Số hiệu mẫu A260/A280 Nồng độ DNA (ng/µL)
210120 1,90 14,8 210091 1,40 4,7 210093 2,14 83,6 210126 1,79 3 210028 1,85 9,7 210135 1,70 3 210009 1,96 10,6 210098 2,02 84 210259 1,86 100 210130 1,90 28,9 210099 1,83 20 210258 2,05 295,8 210189 2,13 559 210109 1,99 49,6
Hệ số OD260nm/280nm của bảy (07) mẫu nằm trong giới hạn từ 1,8 – 2,0 chứng tỏ DNA của các mẫu này tách chiết được là tinh sạch, tuy nhiên cĩ một số mẫu 210091, 210093, 210126, 210135, 210098, 210258, 210189 cĩ hệ số OD260nm/280nm từ dưới 1,8 và trên 2,0 là kết quả khơng tốt. Do dĩ, để xác nhận chất lượng DNA tách được chúng tơi tiến hành diện di DNA tổng số trên gel algarose 1.5%. Kết quả thể hiện trên hình 3.5 cho thấy đã tách thành cơng DNA của các mẫu rong biển thu được và DNA đạt chất lượng tốt để PCR khuếch đại gen mong muốn.
Hình 3. 5. Kết quả điện di DNA tổng số trên gel algarose 1.5%
Chú giải: sản phẩm PCR chạy điện di trên gel agarose 2%; 1- 210120; 2- 210091; 3- 210093; 4- 210126; 5- 210028; 6-210135; 7- 210009; 8- 210098; 9- 210259; 10- 210130; 11- 210099; 12- 210258; 13- 210189; 14- 210109; P: mẫu DNA thực vật làm đối chứng dương; M: ladder 100bp
3.1.2.2. Kết quả nhân gen (PCR)
Kết quả cho thấy sản phẩm PCR nằm giữa vạch 800bp và 900bp trên thang kích thước chuẩn (ladder thermo 100bp), cho thấy kích thước phân tử của sản phẩm PCR phù hợp với kích thước theo tính tốn ban đầu (Hình 3.6).
Hình 3. 6. Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1.5%
Chú giải1- 210120; 2- 210091; 3- 210093 ; 4- 210126; 5- 210028; 6- 210135 ; 7- 210009; 8- 210098; 9-210259; 10- 210130; 11- 210099; 12- 210258 ; 13- 210189; 14- 210109; L- Ladder
Nhận thấy các băng (5-6-7-8-9) sáng đậm, rõ nét, tập trung. Đoạn gen vùng
tufA đã được khuếch đại thành cơng. Các giếng cịn lại xuất hiện smear, khơng hiện rõ các băng, do đĩ các mẫu nghiên cứu này nhân gen khơng thành cơng. Tuy nhiên để xác định chính xác các băng cĩ được khếch đại thành cơng hay khơng, sản phẩm PCR cần phải tinh sạch và đọc trình tự gen trực tiếp.
3.1.2.3. Kết quả giải trình tự gen
Sản phẩm PCR của 5 mẫu (210028; 210135 ; 210009; 210098; 210259) sau khi tinh sạch bằng Kit ThermoScientific được gửi đi đọc trình tự bằng máy đọc trình tự gen ABI3100 của hãng Macrogen, Korea. Phản ứng đọc trình tự gen trực tiếp sử dụng hai mồi xuơi – ngược cho kết quả trình tự gen hai chiều. Sở dĩ phải dùng cả mồi xuơi và mồi ngược vì đoạn DNA cần xác định dài khoảng 900bp mà khi đọc theo một chiều thường bị nhiễu ở hai đầu, trong khi đĩ nghiên cứu này cần sự chính xác đến từng nucleotide. Từ kết quả đọc trình tự gửi về thì trình tự nucleotide đọc theo mồi ngược của các giếng 5- 210028; 6-210135 ; 7- 210009 khơng tốt, bị nhiễu nhiều. Vì điều kiện thời gian khơng cho phép tiến hành thí nghiệm lại nên luận văn chỉ phân tích những trình tự nucleotide đọc tốt theo cả hai chiều của mẫu tại các giếng số 8-210098; 9-210259. Trình tự gen thu được từ kết quả đọc trình tự được phân tích bằng phần mềm BioEdit, so sánh trình tự gen từ kết quả đọc mồi xuơi và mồi ngược đưa lại kết quả trình tự gen tin cậy với kích thước là 866bp.
Hình 3. 8. Kết quả giải trình tự gen mẫu 210098 với mồi GtufAR
Hình 3. 9. Kết quả giải trình tự gen mẫu 210259 với mồi tufGF4
Hình 3. 10. Kết quả giải trình tự gen mẫu 210259 với mồi GtufAR
Sau đĩ, những trình tự nucleotide được đưa vào chương trình BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) của NCBI (National Center for Biotechnology Information) để tìm ra những trình tự cĩ sự giống nhau lớn và so sánh những sai khác giữa chúng (Hình 3.11 và Hình 3.12).
Hình 3. 11. Kết quả Blast với trình tự gen 210098 trên Genabank
Hình 3. 12. Kết quả Blast với trình tự gen 210259 trên Genbank
Kết quả từ chương trình BLAST cho thấy cĩ rất nhiều đoạn trình tự vùng chloroplast của Ulva lactuca với kích thước khoảng 866bp cĩ sự giống nhau lớn (100%) so với trình tự gen 210098 và 210259 tham chiếu. Qua đĩ xác định các mẫu 210098 và 210259 là Ulva lactuca, kết quả này thể hiện sự chính xác của phương pháp hình thái so sánh trước đĩ. Qua đĩ khẳng định, phương pháp sử
dụng mã vạch DNA vùng gen tufA cĩ thể được coi là một cơng cụ hỗ trợ định loại chính xác các lồi rong biển chi Ulva.
Hai trình tự gen 21098 và 210259 được đăng ký và cấp mã số đăng ký Genbank lần lượt là: 2498877, 2500504.
3.2. LỰA CHỌN HỆ THỐNG PHÂN LOẠI RONG BIỂN CHI ULVA TẠI HẢI PHỊNG HẢI PHỊNG
Qua tìm hiểu các hệ thống phân loại của chi rong biển Ulva trên thế giới và các vùng lân cận, hệ thống của Hayden và cộng sự [15] tỏ ra ưu việt hơn tất cả các hệ thống khác. Hệ thống đã kế thừa các kết quả dựa trên kết hợp nghiên cứu hình thái học và sinh học phân tử, số lượng taxon và vùng phân bố rộng lớn, đặc biệt là nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại; sự thành lập các bậc taxon trong chi là rõ ràng và đầy đủ số lượng lồi trên thế giới sau khi chỉnh lý tất cả các lồi thuộc chi Enteromorpha được chuyển sang chi Ulva. Bên cạnh đĩ khi nghiên cứu các đại diện thuộc chi Ulva ở Hải Phịng, nhận thấy các đặc điểm phân loại và sắp xếp các taxon hầu như phù hợp với hệ thống của Hayden (2003). Theo đĩ chi Ulva thuộc họ Ulvaceae trong bộ Ulvales, lớp Ulvophyceae, ngành Chlorophyta.
Chính vì vậy, luận văn đã lựa chọn hệ thống này làm cơ sở cho việc sắp xếp các taxon của chi Ulva ở Hải Phịng trong khĩa định loại dưới đây.
KHĨA ĐỊNH LOẠI CÁC LỒI RONG BIỂN THUỘC CHI ULVA PHÂN BỐ TẠI HẢI PHỊNG
1a. Tản dạng phiến lá, lát cắt ngang gồm 2 hàng tế bào………...2 1b. Tản dạng ống, lát cắt ngang gồm 1 hàng tế bào……….5 2a. Thân do nhiều phiến dạng lá nhỏ từ 1 đến 2cm xếp chồng lên nhau thành dạng bơng hoa…………..………..1.U. conglobata 2b. Thân do các phiến lá lớn hơn 2 cm, khơng xếp chồng lên nhau thành dạng bơng hoa……….3 3a. Phiến lá ít lỗ tự nhiên, mép lá cĩ gai hoặc hình răng cưa.
4a. Phiến lá khơng xe thùy, mép lá cĩ gai………...………. 2. U. spinulosa 4b. Rong xẻ thùy thành các phiến khơng xuyên gốc, mép lá răng cưa và gợn sĩng………..………...……...………… 3. U. lactuca 3b. Phiến lá nhiều lỗ tự nhiên, mép lá khơng cĩ gai ……….……4. U. fenestrata 5a. Tế bào cĩ 1 hạt tạo bột………..6
5b. Tế bào cĩ 2 hạt tạo bột trở lên……….….8 6a. Thân đơn, khơng chia nhánh hoặc chỉ cĩ ít nhánh lơng nhỏ 1 hàng tế bào ở phần gốc, đỉnh xoắn vặn………...……...………..5. U. intestinalis 6b. Thân chia nhánh, đỉnh khơng xoắn vặn………..………...7 7a. Chia nhánh chủ yếu ở phần gốc, tế bào hình đa giác gĩc nhọn khơng đều, sắp xếp khơng theo trật tự………...………….……6. U. compressa 7b. Chia nhánh khắp thân, đối xứng theo kiểu lơng chim, nhìn từ bề mặt tế bào hình chữ nhật hoặc hình vuơng sắp xếp theo hàng dọc tại phần gốc của các nhánh…..………..………....7. U. prolifera 8a. Rong khơng chia nhánh hoặc chia nhánh rất ít, dưới 3 nhánh chủ yếu ở phần gốc……….9 9a. Thân do 2-3 hàng tế bào, sắp xếp theo trật tự...….………...8. U. ralfsii 9b. Thân dài và hẹp, do 4-8 hàng tế bào, cĩ 2-4 hạt tạo bột…………....9. U. kylinii 8b. Rong chia nhánh rất nhiều, trên 3 nhánh...………..…10 10a. Rong chỉ chia nhánh ở phần gốc, thân mập, xoắn vặn, do 8-15 hàng tế bào, cĩ 4-8 hạt tạo bột………..10. U. flexuosa 10b. Rong chia nhánh khắp thân, tế bào to hình trịn hoặc đa giác bo cạnh, sắp xếp đều nhau, cĩ 2-10 hạt tạo bột………..………..…..11. U. clathrata
3.3. THẢO LUẬN
Trong nghiên cứu này, tuy tần suất khảo sát tại 11 điểm nghiên cứu chỉ 1 lần trong năm nhưng cũng cĩ thể đại diện cho rong biển chi Ulva tại các khu vực nghiên cứu vì thời điểm khảo sát trùng vào mùa vụ của rong biển. So với một số kết quả nghiên cứu trước đây tại các khu vực khác, thì số lượng lồi tại các điểm nghiên cứu này thuộc Hải Phịng tương đối lớn (Bảng 3.5).