NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu

Nguyên liệu nghiên cứu là hạt tiêu đen được thu hái vào đầu tháng 6 năm 2020 ở tỉnh Bình Định (Hình 2.1).

Để lấy tinh dầu của hạt tiêu đen thì sử dụng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước có chất lượng đồng đều, không bị sâu bệnh. Hạt tiêu đen sau khi thu hái thì loại bỏ các loại hạt hỏng, làm sạch, để ráo nước và làm nhỏ (Hình 2.2).

Hình 2.1. Hạt tiêu đen Hình 2.2. Bột tiêu đen 2.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

2.2.1. Thiết bị và dụng cụ

Tủ sấy Controller, cân phân tích Satorius CP224S, bộ chưng cất tinh dầu nhẹ Clevender, cao nấm men, khúc xạ kế Abbe, buret, ống sinh hàn, máy quang phổ Bioteck, máy Elisa,…

Các dụng cụ thí nghiệm khác như: cốc thủy tinh, bình tam giác, bếp cách thuỷ, cốc sứ, pipet, bình định mức, bình hút ẩm, nhiệt kế, cối chày sứ, giấy lọc,...

2.2.2. Hóa chất

Nước cất, môi trường LB, agar, pepton, ethanol 96°, cao nấm men, NaCl, Na2SO4, KOH, phenolphatalein,…

2.3. Phương pháp đánh giá cảm quan tinh dầu của hạt tiêu đen TCVN 8460:2010

Xác định độ trong và màu sắc: Dùng ống hút lấy 2mL mẫu cho vào ống nghiệm khô, sạch, trong suốt. Dùng mắt quan sát độ trong và màu sắc của tinh dầu.

23

Xác định vị: Cân khoảng 1g đường kính cho vào chén thử khô, sạch. Sau đó nhỏ vài nhọt tinh dầu vào chén trộn đều, dùng lưỡi xác định vị của hỗn hợp.

Xác định mùi: Nhỏ vài giọt tinh dầu lên giấy thấm khô, sạch. Sau đó dùng mũi xác định mùi của tinh dầu, cứ 15 phút xác định một lần, khoảng 4 - 5 lần.

2.4. Phương pháp xác định chỉ số hóa lý cơ bản của tinh dầu hạt tiêu tỉnh Bình Định, Việt Nam Định, Việt Nam

2.4.1. Xác định chỉ số khúc xạ tinh dầu hạt tiêu đen theo TCVN 8445:2010

Chỉ số khúc xạ được xác định theo phương pháp đo góc giới hạn bằng khúc xạ kế kiểu Abbe ở 20oC bằng cách cho dòng nước chảy qua máy để duy trì máy ở 20oC.

Đầu tiên điều chỉnh máy nhằm tiêu diệt hiện tượng tán sắc ánh sáng để có thể thấy rõ ranh giới giữa miền tối, sáng của thị trường. Sau đó chuẩn lại để thấy rõ nét vạch chuẩn chữ thập giữa thị trường.

Mở hộp lăng kính, dùng bông tẩm axeton lau kỹ lăng kính và thấm khô bằng vải mềm. Nhỏ 2 - 3 giọt tinh dầu lên mặt lăng kính mờ phía dưới và áp vào lăng kính bên trên.

Khi nhiệt kế của khúc xạ kế chỉ 20oC, nhìn vào thị kính, chỉnh hiện tượng tán sắc nếu có rồi từ từ xoay bộ lăng kính đưa ranh giới giữa hai miền sáng và tối cắt đúng giao điểm của vạch chuẩn.

Đọc chỉ số khúc xạ ở ngang vạch chuẩn. Xác định lại vị trí và đọc chỉ số ba lần. Chú ý chỉ đọc chỉ số khi nhiệt kế đã ổn định.

Kết quả là trung bình cộng của 3 giá trị đọc được và làm tròn tới số thập phân thứ tư. Khi đo chỉ số khúc xạ của tinh dầu ở nhiệt độ khác nhau và cần chuyển về chỉ số khúc xạ ở nhiệt độ nhất định.

Chỉ số khúc xạ được tính theo công thức sau: NtD = Nt’

D + 0,0004.(t’– t) Trong đó NtD: Chỉ số đọc được ở nhiệt độ t

t: Nhiệt độ cần tính chuyển

2.4.2. Xác định tỷ trọng tinh dầu hạt tiêu đen ở 25°C theo TCVN 8444:2010

Tỷ trọng của tinh dầu là tỷ số của khối lượng tinh dầu ở 25oC với khối lượng của cùng một thể tích nước cất cũng ở 25oC.

24

Bình tỷ trọng được rửa sạch bằng hỗn hợp sunfocromic, tráng kỹ bằng nước cất và xúc sạch bằng axeton hoặc ethanol, làm khô bằng cách thổi vào bình một luồng khí khô, nóng hoặc sấy nhẹ ở nhiệt độ 70 - 80oC tới khối lượng không đổi. Cân khối lượng của bình và nút chính xác tới 0,0002 g.

Rót nhẹ nước cất vào bình cao hơn bình định mức một chút, tránh không tạo bọt khi rót. Ngâm bình vào môi trường điều nhiệt đã duy trì ở 25 ± 0,5oC ngập tới cổ lọ trong 30 phút tới khi nhiệt độ của nước trong bình đạt 25 ± 0,5oC. Dùng các giấy thấm hút bớt nước trong bình tới đúng vạch định mức và thấm khô các giọt nước bám ở thành trong cổ bình, lau khô cổ bình và đậy nút. Lấy bình ra khỏi môi trường điều nhiệt, cân nhanh chính xác đến 0,0002g. Sau đó đổ nước vào và làm khô như trên. Rót nhẹ tinh dầu vào bình và chú ý không tạo bọt khi rót và tiến hành giống như làm với nước cất. Xác định được khối lượng của bình và tinh dầu ở 25 ± 0,5oC.

Tỷ trọng của tinh dầu ở 25oC được tính theo công thức sau : d2525 = m2-m/m1-m

Trong đó m: Khối lượng bình tỷ trọng, g

m1: Khối lượng bình tỷ trọng và nước ở 25oC, g m2: Khối lượng bình tỷ trọng và tinh dầu ở 25oC, g

2.4.3. Xác định chỉ số acid của tinh dầu hạt tiêu đen theo TCVN 8450:2010

Chỉ số acid là số mg KOH cần dùng để trung hòa acid tự do có trong 1 gam tinh dầu.

Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên sự trung hòa acid tự do có trong tinh dầu bằng dung dịch kiềm chuẩn theo phản ứng:

RCOOH + KOH → RCOOK + H2O. Tiến hành:

Cân 2g tinh dầu (chính xác đến 0,005g) vào bình cầu xà phòng hóa. Thêm vào đó 10 mL ethanol (ethanol 95% thể tích ở 20oC, đã được trung hòa bằng KOH 0,1N trong ethanol) và vài giọt chất chỉ thị màu phenolphtalein (0,2% trong ethanol).

Chuẩn độ bằng dung dịch KOH 0,1N trong ethanol (chuẩn bị trước 24h) đến khi xuất hiện màu hồng bền vững trong vòng 30 giây. Ghi số mL KOH tiêu tốn.

25

A= 5,61.V/m

Trong đó V: Lượng dung dịch KOH 0,1N đã dùng để chuẩn độ, mL m: Khối lượng tinh dầu, g

5,61: Lượng KOH có trong 1mL dung dịch KOH 0,1N, mg

2.4.4. Xác định chỉ số este tinh dầu hạt tiêu đen theo TCVN 8451:2010

Nguyên tắc: Xà phòng hóa este bằng dung dịch KOH trong ethanol theo phản ứng:

RCOOR’ + KOH → RCOOK + R’OH. Tiến hành:

Dùng buret cho 20 mL dung dịch KOH 0,5N vào bình cầu để xà phòng hóa có chứa lượng mẫu đã xác định chỉ số acid, lắp ống sinh hàn khí và đun sôi nhẹ trong 1 giờ.

Cùng một lúc trong bình cầu khác kiểm tra song song một mẫu trắng gồm 10 mL ethanol và 20 mL dung dịch KOH 0,5N trong cồn. Đun xong để nguội cho vào cả 2 bình, mỗi bình 5 giọt chỉ thị màu phenolphtalein 2%. Chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 hoặc HCl 0,5N.

Chỉ số este (X3) được tính theo công thức:

X3= (V-V1).28,05/m Trong đó: X3: Chỉ số este của tinh dầu, mg KOH/g

V: Lượng dung dịch H2S04 hay HCl 0,5N để chuẩn độ mẫu trắng, mL

V1: Lượng dung dịch H2S04 hay HCl 0,5N để chuẩn độ mẫu thử,mL m: khối lượng mẫu,g

2.5. Xác định hoạt tính sinh học của tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam Nam

2.5.1. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam

Các chủng vi sinh vật được cung cấp bởi khoa Khoa học Sự sống, Trường Đại học USTH, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam bao gồm: Candida albicans ATCC 10231, Staphylococcus aureus ATCC 12493, Enterococcus Feacalis ATCC 51299, Escherichia Coli ATCC 35218, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603.

26

Các bước tiến hành: Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng VSVKĐ và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là tỷ lệ ức chế. Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO ở dải nồng độ giảm dần: 256µg/ml, 128µg/ml, 64µg/ml, 32µg/ml, 16µg/ml, 8µg/ml, 4µg/ml và 2µg/ml với số thí nghiệm lặp lại N=3. Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 2×104 CFU/ml.

Tiến hành thử: Lấy 5,12 l dung dịch mẫu thử có nồng độ 10mg/ml vào hàng đầu tiên có chứa 100l môi trường LB rồi pha loãng nối tiếp giảm ½ nồng độ vào các hàng có chứa 50l cho đến khi đạt được nồng độ là 2 g/ml, thêm 50 l dung dịch vi khuẩn và nấm ở nồng độ 2×104 CFU/ml, ủ ở 37oC. Sau 24h, xác định sơ bộ giá trị MIC bằng quan sát. Giá trị tỷ lệ ức chế được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật sau 24 giờ nuôi cấy và được xác định chính xác dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ Bioteck và phần mềm Raw data. Chất đối chứng là kháng sinh Streptomycin và Kanamycin cho các chủng vi khuẩn. Nistatin và cyclohexamide cho nấm.

2.5.2. Xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH của tinh dầu hạt tiêu đen của tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam

Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu được xác định thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH). Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela et al. (2003). Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống ôxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm.

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính sẽ được thử nghiệm để tìm giá trị IC50. Giá trị IC50 được xác định thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 50% các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hòa bởi chất thử.

27

2.5.3. Xác định khả năng ức chế tế bào ung thư gan HepG2 của tinh dầu hạt tiêu đen tại tỉnh Bình Định, Việt Nam tại tỉnh Bình Định, Việt Nam

Dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp là dòng tế bào ung thư gan HepG2. Phương pháp thử độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ (National Cancer insitute – NCl) xác nhận là phép thử độc độc tế bào khuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng prtotein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Opocal Density) đo được khi thành phafnaprotein của tế bào được nhuộm bằng sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

Chất thử Chất thử (10 L) pha trong DMSO 10% (trong nước cất vô trùng) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ sàng lọc là 100 g/mL. Chất thử có hoạt tính được xác định IC50 nhờ dải nồng độ 100; 20; 4; 0,8 g/mL. Mỗi nồng độ của mẫu thử được chuẩn bị thành 3 giếng.

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (190 L môi trường) và để chúng phát triển trong vòng 3-5 ngày.

- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (190 L) được chuẩn bị thành 3 cột để làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng trichloroacetic acid –TCA.

- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37 oC. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. - Cuối cùng, sử dụng dung dịch tris(hydroxymethyl)aminomethane 10 mM để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa, lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB thông qua phổ hấp thụ ở bước sóng 515-540 nm. Phần trăm tế bào bị ức chế khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

28 % Tế bào bị ức chế = 100% -

[OD (chất thử) – OD (ngày 0)] x 100 [OD (đối chứng âm) – OD (ngày 0)] - Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma- Aldrich, Mỹ) ở các nồng độ 10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL luôn được sử dụng làm chất đối chứng dương. DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4 (System software Inc., San Jose, California, Mỹ)

29

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1. Kết quả các chỉ tiêu cảm quan của tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam Nam

Kết quả sản phẩm tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước được thể hiện ở Hình 3.1 và so sánh kết quả các chỉ tiêu cảm quan của tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam với các chỉ tiêu cảm quan của tinh dầu hạt tiêu đen ở Việt Nam và trên thế giới được trình bày ở Bảng 3.1.

Hình 3.1. Hình ảnh tinh dầu hạt tiêu đen

30

Bảng 3.1. So sánh kết quả các chỉ tiêu cảm quan của tinh dầu hạt tiêu đen ở Việt Nam và trên thế giới

Nhận xét: Từ kết quả thu được ở Bảng 3.1 cho thấy các chỉ tiêu cảm quan của

tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam so với các chỉ tiêu cảm quan của Việt Nam và thế giới tương đối giống nhau. So sánh kết quả thu được thì cho thấy tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam có chất lượng tốt.

3.2. Kết quả các chỉ số hóa lý cơ bản của tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam Việt Nam

3.2.1. Kết quả chỉ số khúc xạ của tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam.

Kết quả chỉ số khúc xạ tinh dầu hạt tiêu đen ở tình Bình Định, Việt Nam được thể hiện ở Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Kết quả chỉ số khúc xạ của tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam

Chỉ tiêu

Kết quả

Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB

Chỉ số khúc xạ 1,4794 1,4795 1,4795 1,4795

So sánh kết quả chỉ số khúc xạ tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam với chỉ số khúc xạ của tinh dầu hạt tiêu đen ở Việt Nam và trên thế giới được thể hiện ở Bảng 3.3.

Sản phẩm tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh

Bình Định, Việt Nam

Sản phẩm tinh dầu hạt tiêu đen ở trên thế giới theo nghiên cứu của F.Hoffmann (1929) [6]

Sản phẩm tinh dầu hạt tiêu đen ở Việt Nam theo nghiên cứu

của Đỗ Tất Lợi [17]

Trạng

thái Chất lỏng dễ bay hơi Chất lỏng Chất lỏng

Màu Vàng nhạt Vàng lục nhạt Lục nhạt

Mùi Thơm đặc trưng Có mùi giống của

phelandren Mùi rất hắc

31

Bảng 3.3. So sánh chỉ số khúc xạ của tinh dầu hạt tiêu đen ở Việt Nam và thế giới

Chỉ số khúc xạ của tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh

Bình Định, Việt Nam

Chỉ số khúc xạ của tinh dầu hạt tiêu đen ở trên thế giới theo nghiên cứu của F. Hoffmann (1929)

[6]

Chỉ số khúc xạ của tinh dầu hạt tiêu đen Việt Nam theo nghiên cứu của Đỗ Tất Lợi [17]

1,4795 1,400 – 1499 1,4788 – 1,4789

Nhận xét: Kết quả ở Bảng 3.3 cho thấy chỉ số khúc xạ của tinh dầu hạt tiêu đen ở Việt Nam hay trên thế giới không chênh lệch quá nhiều. Chỉ số này được xác định