Xác định hoạt tính sinh học của tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt

2.2 .Thiết bị, dụng cụ, hóa chất

2.5. Xác định hoạt tính sinh học của tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt

Nam

2.5.1. Xác định hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam

Các chủng vi sinh vật được cung cấp bởi khoa Khoa học Sự sống, Trường Đại học USTH, Viện Hàn lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam bao gồm: Candida albicans ATCC 10231, Staphylococcus aureus ATCC 12493, Enterococcus Feacalis ATCC 51299, Escherichia Coli ATCC 35218, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603.

26

Các bước tiến hành: Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng đa nồng độ. Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng VSVKĐ và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là tỷ lệ ức chế. Mẫu ban đầu được pha loãng trong DMSO ở dải nồng độ giảm dần: 256µg/ml, 128µg/ml, 64µg/ml, 32µg/ml, 16µg/ml, 8µg/ml, 4µg/ml và 2µg/ml với số thí nghiệm lặp lại N=3. Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn hoặc nấm với nồng độ 2×104 CFU/ml.

Tiến hành thử: Lấy 5,12 l dung dịch mẫu thử có nồng độ 10mg/ml vào hàng đầu tiên có chứa 100l môi trường LB rồi pha loãng nối tiếp giảm ½ nồng độ vào các hàng có chứa 50l cho đến khi đạt được nồng độ là 2 g/ml, thêm 50 l dung dịch vi khuẩn và nấm ở nồng độ 2×104 CFU/ml, ủ ở 37oC. Sau 24h, xác định sơ bộ giá trị MIC bằng quan sát. Giá trị tỷ lệ ức chế được xác định tại giếng có nồng độ chất thử thấp nhất gây ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật sau 24 giờ nuôi cấy và được xác định chính xác dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy quang phổ Bioteck và phần mềm Raw data. Chất đối chứng là kháng sinh Streptomycin và Kanamycin cho các chủng vi khuẩn. Nistatin và cyclohexamide cho nấm.

2.5.2. Xác định khả năng bắt gốc tự do DPPH của tinh dầu hạt tiêu đen của tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam

Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu được xác định thông qua phản ứng bao vây gốc tự do (DPPH). Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela et al. (2003). Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống ôxy hoá được đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm.

Các mẫu có biểu hiện hoạt tính sẽ được thử nghiệm để tìm giá trị IC50. Giá trị IC50 được xác định thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 50% các gốc tự do tạo bởi DPPH được trung hòa bởi chất thử.

27

2.5.3. Xác định khả năng ức chế tế bào ung thư gan HepG2 của tinh dầu hạt tiêu đen tại tỉnh Bình Định, Việt Nam tại tỉnh Bình Định, Việt Nam

Dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp là dòng tế bào ung thư gan HepG2. Phương pháp thử độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ (National Cancer insitute – NCl) xác nhận là phép thử độc độc tế bào khuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc tiêu diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng prtotein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Opocal Density) đo được khi thành phafnaprotein của tế bào được nhuộm bằng sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

Chất thử Chất thử (10 L) pha trong DMSO 10% (trong nước cất vô trùng) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ sàng lọc là 100 g/mL. Chất thử có hoạt tính được xác định IC50 nhờ dải nồng độ 100; 20; 4; 0,8 g/mL. Mỗi nồng độ của mẫu thử được chuẩn bị thành 3 giếng.

- Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

- Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (190 L môi trường) và để chúng phát triển trong vòng 3-5 ngày.

- Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (190 L) được chuẩn bị thành 3 cột để làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng trichloroacetic acid –TCA.

- Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37 oC. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. - Cuối cùng, sử dụng dung dịch tris(hydroxymethyl)aminomethane 10 mM để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa, lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB thông qua phổ hấp thụ ở bước sóng 515-540 nm. Phần trăm tế bào bị ức chế khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

28 % Tế bào bị ức chế = 100% -

[OD (chất thử) – OD (ngày 0)] x 100 [OD (đối chứng âm) – OD (ngày 0)] - Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma- Aldrich, Mỹ) ở các nồng độ 10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL luôn được sử dụng làm chất đối chứng dương. DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4 (System software Inc., San Jose, California, Mỹ)

29