Vi sinh vật MIC (μg/mL) Bacillus subtilis 2,0 Pseudomanas aeruginosa 4,0 Aspergillus niger 10,0 Penicillium spp 5,0 Candida albicans 4,0 Saccharomyces cerevisiae 0,8 Trichoderma spp 10,0
Gần đây nhất, năm 2012, Nguyễn Thanh Huệ và công sự cho biết hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu hạt tiêu đen ở Việt Nam [10]
37
Bảng 1.20. Hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu hạt tiêu đen ở Việt Nam
Vi sinh vật MIC (mg/mL)
Bacillus subtilis ATCC 6633 6.25
Enterococus feacalis ATCC 29212 6.25
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 50
Staphylococcus aureus ATCC25923 6.25
Samonella typhi Ty2 6.25
Candida albicans ATCC 10231 6.25
1.2.4.2.Khả năng ức chế tế bào ung thư
Khoảng 20 năm trở lại đây, cùng với xu hướng đẩy mạnh việc tìm kiếm thuốc chữa ung thư trên toàn thế giới, đã có khá nhiều nghiên cứu về tác dụng gây độc tế bào của chi Piper L. Kết quả thu được cho thấy rất nhiều hợp chất phân lập từ chi này có tính gây độc trong đó có piperin thuộc nhóm alkaloid có trong tinh dầu hạt tiêu. Piperin là một trong những hợp chất được nghiên cứu nhiều nhất về tác dụng chống ung thư bởi tiềm năng về tác dụng sinh học của nó. Theo kết quả của một số nghiên cứu, piperin có tác dụng chống ung thư theo một số cơ chế như: điều chỉnh nồng độ carbonhydrat gắn protein (chất chỉ thị cho xu hướng phát triển khối u), ức chế sản xuất TNF-α (yếu tố hoại tử khối u), làm giảm lượng hydroperoxid, ức chế sự di căn ở phổi… trên động vật thực nghiệm.
38
1.3. Tình hình sản xuất và tiêu thụ tinh dầu hạt tiêu đen trên thế giới và ở Việt Nam
Ngày nay, xã hội ngày càng phát triển nhu cầu đời sống của con người ngày một tăng cao đặc biệt là các vấn đề liên quan đến sức khỏe, làm đẹp và y học. Người tiêu dùng có xu hướng quan tâm đến việc sử dụng các hợp chất từ thiên nhiên, nhu cầu sử dụng tinh dầu ngày một tăng đặc biệt là trong hương trị liệu và công nghiệp mỹ phẩm. Một trong những loại nguyên liệu sản xuất tinh dầu được các nhà khoa học trên thế giới cũng như Việt Nam quan tâm là hạt tiêu đen.
Ấn Độ là nước có ngành công nghiệp chế biến tinh dầu hồ tiêu hàng đầu thế giới. Bên cạnh đó còn có các nước Trung Quốc, Hàn Quốc và các nước khu vực Châu Âu có ngành công nghiệp tinh dầu phát triển mạnh mẽ. Tuy nhiên, do tính đặc trung về khí hậu phát triển của cây hồ tiêu nên một số nước phải nhập khẩu từ nước ngoài với giá thành cao.
Trong khi đó, Việt Nam với điều kiện khí hậu và đất đai vô cùng thuận lợi để trồng cây hồ tiêu. Diện tích trồng hồ tiêu có diện tích lớn khoảng 137,7 nghìn ha với năng suất và chất lượng đảm bảo. Tuy ngành công nghiệp tinh dầu có phát triển nhưng vẫn còn hạn chế nên chưa thể khai thác triệt để tiềm năng về tinh dầu như những nước khác, không đủ số lượng và chất lượng để đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng. Thị trường tiêu thụ tinh dầu tiêu trong nước chủ yếu là từ tinh dầu nhập khẩu từ các nước khác như Ấn Độ, Trung Quốc, … với giá thành cao hơn nhiều so với sản phẩm được sản xuất trong nước.
1.4. Các phương pháp thu nhận tinh dầu
Dựa trên cách thực hành, người ta chia các phương pháp sản xuất tinh dầu ra làm bốn loại: cơ học, trích ly, hấp thụ và chưng cất lôi cuốn hơi nước. Nhưng dù tiến hành theo bất cứ phương pháp nào, quy trình sản xuất đều có những điểm chung sau đây: Tinh dầu thu được phải có mùi thơm tự nhiên như nguyên liệu; Quy trình khai thác phải phù hợp với nguyên liệu, với chi phí thấp nhất; Nguyên tắc trích ly của các phương pháp nói trên đều dựa vào đặc tính của tinh dầu như: Dễ bay hơi, lôi cuốn theo hơi nước ở nhiệt độ dưới 100oC, hòa tan dễ dàng trong dung môi hữu cơ, dễ hấp thu ngay ở thể khí.
1.4.1. Phương pháp trích ly
Trích ly bằng dung môi dễ bay hơi có nhiều ưu điểm vì tiến hành trích ly ở nhiệt độ phòng nên thành phần tinh dầu ít bị thay đổi. Phương pháp này dựa trên hiện tượng thẩm thấu, khuếch tán và hòa tan của tinh dầu trong các mô cây đối với các dung môi hữu cơ.
39 Phương pháp này không những được áp dụng để trích ly cô kết (concrete) từ hoa mà còn dùng để tận trích khi các phương pháp khác không trích ly hết được hoặc dùng để trích ly các loại nhựa dầu (oleoresin) gia vị. Phương pháp trích ly này thích hợp với các loại nguyên liệu có chứa lượng tinh dầu không lớn lắm hoặc có chứa những cấu phần tan được trong nước và không chịu được nhiệt độ quá cao.
1.4.2. Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
Phương pháp này dựa trên sự thẩm thấu, hòa tan, khuếch tán và lôi cuốn hơi nước của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước ở nhiệt độ cao. Sự khuếch tán sẽ dễ dàng khi tế bào chứa tinh dầu trương phồng do nguyên liệu tiếp xúc với hơi nước bão hòa trong một thời gian dài vì những hợp chất này làm giảm áp suất hơi chung của hệ thống và làm cho sự khuếch tán trở nên khó khăn.
1.4.3. Các phương pháp mới trong trích ly tinh dầu
a. Trích ly Soxhlet
Phương pháp trích ly Soxhlet là phương pháp trích ly rắn – lỏng thường được sử dụng trong thí nghiệm tổng hợp hoặc phân tích khi hợp chất nghiên cứu có khả năng hòa tan hạn chế trong dung môi và tạp chất không hòa tan trong dung môi đó. Phương pháp này được sử dụng vì tính đơn giản, chi phí tương đối thấp, hiệu quả chiết cao và dễ sử dụng.
Quá trình trích ly Soxhlet được thực hiện bên trong một bộ chiết gọi là “bộ chiết Soxhlet”, mỗi bộ gồm 3 bộ phận: bình chứa dung môi, ống chiết và ống sinh hàn. Sau khi tiền xử lý, mẫu được đặt vào trong một đầu lọc, đầu lọc này được đặt vào trong ống chiết. Khi đun nóng bình chứa, dung môi sẽ chuyển sang trạng thái hơi và rơi xuống mẫu nằm trong đầu lọc. Ống chiết chứa mẫu sẽ dần dần được làm đầy bằng dung môi còn ấm, cho đến khi đầy thì toàn bộ dung môi chứa tinh dầu sẽ được chuyển về lại bình chứa thống qua ống siphon.
Khi tinh dầu xuống bình chứa dung môi, chúng sẽ không tham gia vào các chu kỳ sau. Chỉ có dung môi sạch tiếp tục bay hơi và tham gia vào chu kỳ tiếp theo, đây là lợi thế chính của phương pháp trích ly Soxlet. Sau nhiều chu kỳ trong nhiều giờ liền (6-24 giờ), bộ chiết Soxlet sẽ được tháo ra và phần dung môi chứa tinh dầu sẽ được cô cạn, giữ lại chất được trích ly để tiếp tục nghiên cứu.
40
b. Trích ly dưới sự hỗ trợ của vi sóng
Dưới tác động của vi sóng, nước trong các tế bào thực vật bị nóng lên, áp suất bên trong tăng đột ngột làm các mô chứa tinh dầu vỡ ra. Tinh dầu thoát ra bên ngoài, lôi cuốn theo hơi nước sang hệ thống ngưng tụ (phương pháp chưng cất hơi nước) hoặc hòa tan dùng dung môi hữu cơ đang bao phủ bên ngoài nguyên liệu (phương pháp tẩm trích). Lưu ý là mức độ chịu ảnh hưởng vi sóng của các loại mô khác nhau, ngay khi nguyên liệu được làm nhỏ. Kết quả này được phản ánh qua thời gian trích ly. Trong quá trình chưng cất hơi nước, việc trích ly tinh dầu có thể thực hiện trong điều kiện thêm nước hay không thêm nước vào nguyên liệu (trường hợp nguyên liệu chứa nhiều nước, đây là đặc điểm của phương pháp chưng cất hơi nước dưới sự hỗ trợ của vi sóng). Ngoài ra, nước có thể thêm một lần hoặc thêm liên tục ( trường hợp lượng nước thêm một lần không đủ lôi cuốn hết tinh dầu trong nguyên liệu) cho đến khi sự trích ly chấm dứt. Ngoài việc nước bị tác dụng nhanh chóng, các cấu phần phân cực (hợp chất chứa oxigen) hiện diện trong tinh dầu cũng bị ảnh hưởng bởi vi sóng. Ngược lại các cấu phần hidrocarbon ít chịu ảnh hưởng của vi sóng. Năm 1988, Luque de Castro và cộng sự đã đưa ra kiểu lò vi sóng tiêu điểm hỗ trợ cho sự trích ly bằng Soxhlet (FMASE – Focused Microwave Assisted Soxhlet Extraction). Hệ thống này giúp cho thời gian trích ly hợp chất thiên nhiên sử dụng Soxhlet giảm xuống đáng kể và khả năng bảo vệ những hợp chất dễ bị phân hủy tăng lên.
c. Trích ly dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm
Trong lĩnh vực hợp chất thiên nhiên, sóng siêu âm chủ yếu sử dụng để hỗ trợ phương pháp tẩm trích giúp thu ngắn thời gian trích ly. Trong một số trường hợp, phương pháp siêu âm cho hiệu suất cao hơn phương pháp khuấy từ. Trong trường hợp tinh dầu vì sự trích ly dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm được thực hiện ở nhiệt độ phòng nên sản phẩm có mùi thơm tự nhiên. Các thiết bị siêu âm hiện nay chủ yếu bao gồm hai dạng: Bồn siêu âm (40 kHz) và thanh siêu âm trong phương pháp trích ly.
d. Phương pháp CO2 lỏng siêu tới hạn
Trích ly bằng CO2 siêu tới hạn cho tinh dầu thu được lớn hơn nhiều so với phương pháp chiết xuất khác. Tuy nhiên giá thành rất đắt, gấp 5 – 10 lần so với phương pháp chiết xuất thông thường, chỉ sử dụng cho các loại tinh dầu quý.
41
CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu nghiên cứu là hạt tiêu đen được thu hái vào tháng 6 năm 2020 tại huyện Hoài Ân, tỉnh Bình Định, Việt Nam.
Hạt tiêu đen sử dụng cho quá trình chưng cất lôi cuốn hơi nước có chất lượng đồng đều và không bị sâu bệnh. Hạt tiêu đen sau khi được thu hái sẽ loại bỏ những hạt hỏng, rửa sạch, để ráo nước và làm nhỏ.
Hình 2.1. Hạt hồ tiêu đen
Hình 2.2. Bột hạt hồ tiêu đen 2.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
2.2.1. Thiết bị, dụng cụ
Tủ sấy Controller, cân phân tích Satorius CP224S, bộ chưng cất tinh dầu nhẹ Clevender, khúc xạ kế Atago RX-5000 Alpha, bộ chiết Soxhlet, bồn siêu âm Digital Utrasonic Cleaner.
Các dụng cụ thí nghiệm khác như: cốc thủy tinh, bình tam giác, bếp cách thủy, cốc sứ, pipet, bình định mức, bình hút ẩm, nhiệt kế, cối chày sứ, giấy lọc,…
42
2.2.2. Hóa chất
n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate, ethanol 96%, nước cất 1 lần, Na2SO4,…
2.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố chưng cất đến quá trình chưng cất lôi cuốn hơi nước tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam hơi nước tinh dầu hạt tiêu đen ở tỉnh Bình Định, Việt Nam
2.3.1. Quy trình chưng cất lôi cuốn hơi nước tinh dầu hạt tiêu đen
Quy trình chưng cất lôi cuốn hơi nước tinh dầu tiêu hạt đen được thể hiện ở sơ đồ 1
Hạt tiêu đen (W = 6,44%)
Xay nguyên liệu (2,0 < d < 4,0 mm)
Chưng cất lôi cuốn hơi nước
Ngưng tụ
Tinh dầu + nước
Phân ly
Nước chưng Tinh dầu thô
Sơ chế
Làm khan bằng Na2SO4
Tinh dầu thành phẩm Tinh dầu loại II
43 Thuyết minh quy trình
Lựa chọn nguyên liệu: Nguyên liệu được sử dụng để thu nhận tinh dầu hạt tiêu đen là hạt tiêu đen khô, độ ẩm 6,44%. Hạt tiêu đen thu hái không bị sâu bệnh, hư hỏng. Nguyên liệu sau khi thu nhận về được phơi khô và lưu trữ ở điều kiện nhiệt độ thường (20 – 35oC), thoáng mát.
Xử lý nguyên liệu: Sau khi lựa chọn hạt tiêu đen đảm bảo chất lượng, toàn bộ nguyên liệu này được cho vào thiết bị làm nhỏ tới kích thước d = 2,0 – 4,0 mm.
Tiến hành chưng cất lôi cuốn hơi nước: Nguyên liệu sau khi làm nhỏ, tiến hành chưng cất tinh dầu trong thiết bị chưng cất tinh dầu nhẹ Clevender với các điều kiện tỷ lệ rắn/lỏng và thời gian chưng cất đã khảo sát thu được tinh dầu thô còn lẫn nước. Làm khan hỗn hợp bằng Na2SO4 thu tinh dầu thành phẩm. Nước chưng đã tách tinh dầu thô sẽ thu hồi lưu lại nhằm khép kín quy trình, giảm lượng nước tiêu hao đồng thời hạn chế sự tổn hao tinh dầu còn lại trong nước chưng hoặc cho vào bình chiết tiếp tục phân ly để thu hồi tinh dầu loại II.
Hiệu suất thu nhận tinh dầu hạt tiêu đen được xác định theo công thức:
Trong đó
Y (%): hiệu suất thu tinh dầu V (mL): thể tích tinh dầu thu được
d (g/cm3): khối lượng riêng của tinh dầu hạt tiêu đen, d = 0,875 g/cm3 m (g): khối lượng hạt tiêu đen khô
2.3.2. Khảo sát tỷ lệ rắn (nguyên liệu) /lỏng (dung môi)
100 gam hạt tiêu được chưng cất lôi cuốn hơi nước ở nhiệt độ 80oC trong thời gian 3 giờ với thể tích nước chưng cất thay đổi từ 200 mL đến 600 mL. Sau khi phân ly, tinh dầu thu được vẫn còn lẫn một lượng nước nhất định. Hỗn hợp này được làm khan bằng Na2SO4 thu được tinh dầu hạt tiêu đen thành phẩm.
Đông thể tích tinh dầu hạt tiêu đen thu được. Dựa vào hiệu suất thu tinh dầu hạt tiêu đen (%), lựa chọn tỷ lệ rắn/lỏng thích hợp nhất.
44
2.3.3. Khảo sát thời gian chưng cất
Chưng cất 100 gam hạt tiêu đen với tỷ lệ rắn/lỏng chọn từ phần 2.3.2, trong đó thời gian khác nhau từ 1 giờ đến 5 giờ. Sau khi phân ly, tinh dầu thu được vẫn còn lẫn nột lượng nước nhất định. Hỗn hợp được làm khan bằng Na2SO4 thu được tinh dầu hạt tiêu đen thành phẩm.
Đong thể tích tinh dầu hạt tiêu đen thu được. Dựa vào hiệu suất thu tinh dầu hạt tiêu đen (%), lựa chọn thời gian chưng cất thích hợp nhất.
2.4. Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hiệu suất thu tinh dầu hạt tiêu đen (%) đen (%)
2.4.1. Quy trình trích ly tinh dầu hạt tiêu đen
Quy trình trích ly tinh dầu hạt tiêu đen được thể hiện ở sơ đồ 2.2.
Hạt tiêu đen (W = 6,44%)
Trích ly tinh dầu hạt tiêu đen (Soxhlet và siêu âm)
Mitxen Đuổi dung môi
Cancrết
Tinh dầu thô
Sơ chế làm khan bằng Na2SO4
Tinh dầu thành phẩm Chưng cất hơi nước
Dung môi thu hồi
45 Thuyết minh quy trình
Lựa chọn nguyên liệu: Nguyên liệu được sử dụng để thu nhận tinh dầu hạt tiêu đen là hạt tiêu đen không bị sâu bệnh, hư hỏng.
Xử lý nguyên liệu: Sau khi lựa chọn hạt tiêu đen đảm bảo chất lượng, toàn bộ nguyên liệu này được phơi khô đến độ ẩm 6,44%. Sau đó cho nguyên liệu đã phơi khô vào thiết bị làm nhỏ tới kích thước d = 2,0 – 4,0 mm.
Tiến hành trích ly: Khảo sát trích ly Soxhlet và trích ly dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm dung môi ethanol 96%.
2.4.2. Trích ly Soxhlet
Trích ly Soxhlet 100 gam hạt tiêu đen đã phơi khô đến độ ẩm 6,44% trong 300 mL dung môi ethanol 96% ở nhiệt độ 80oC với thời gian 3 giờ thu được mitxen (là hỗn hợp tinh dầu và dung môi).
Làm khan nước trong mitxen bằng Na2SO4 và lọc. Cô quay chân không mitxen sau khi đã loại nước thu được cancrết (là một hỗn hợp gồm tinh dầu, sáp, nhựa thơm và một số tạp chất khác ở dạng sệt).
Tiến hành chưng cất bằng hơi nước cancrết thu tinh dầu thô. Sau khi phân ly, tinh dầu thu được vẫn còn lẫn một lượng nước nhất định. Hỗn hợp này được làm khan bằng Na2SO4 thu được tinh dầu hạt tiêu đen thành phẩm.
Đong thể tích tinh dầu hạt tiêu đen thu được và xác định hiệu suất thu tinh dầu hạt tiêu đen (%).
2.4.3. Trích ly dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm
Trích ly dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm 100 gam hạt tiêu đen đã phơi khô đến độ ẩm 6,44% trong 300 mL dung môi ethanol 96% ở nhiệt độ 50oC với thời gian 90 phút thu được mitxen (hỗn hợp tinh dầu và dung môi).
Làm khan nước trong mitxen bằng Na2SO4 và lọc. Cô quay chân không mitxen sau khi đã loại nước thu được cancrết (là một hỗn hợp gồm tinh dầu, sáp, nhựa thơm và một số tạp chất khác ở dạng sệt).
Tiến hành chưng cất bằng hơi nước cancrết thu tinh dầu thô. Sau khi phân ly, tinh dầu