56
Bảng 4.16. Kết quả xác định mẫu Phytophthora sp. gây bệnh chảy gôm hại thân cây sầu riêng bằng giải trình tự và tìm kiếm các chuỗi gần gũi
trên GenBank Mã số GenBank MN750010.1 KP183963.1 MH219876.1 LC510501.1 HQ237479.1
Sau khi nhận được kết quả, các trình tự được lắp ráp và loại bỏ các đoạn nhiễu ở hai đầu và tiến hành so sánh với các trình tự có sẵn trên GenBank. Kết
quả so sánh cho thấy các mẫu Phytophthora sp. thu thập được tại Đắk Lắk giống
với Phytophthora palmivora với mức độ đồng nhất trình tự lên tới 99.88% đến 100% trên toàn bộ đoạn so sánh. Như vậy, có thể kết luận rằng: tác nhân gây
bệnh chảy gôm cây sầu riêng tại Đắk Lắk chính là loài Phytophthora palmivora.
4.3. THỬ NGHIỆM HIỆU LỰC ỨC CHẾ CỦA MỘT SỐ VI SINH VẬT ĐỐI KHÁNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN CỦA PHYTOPHTHORA PALMIVORA GÂY BỆNH CHẢY GÔM HẠI THÂN CÂY SẦU RIÊNG
4.3.1. Thử nghiệm hiệu lực ức chế của vi khuẩn đối kháng Bacillus
methylotrophicus đến sự phát triển của Phytophthora palmivora
Hiện nay có rất nhiều loài vi khuẩn đối kháng đã và đang được ứng dụng rộng dãi trong phòng chống sâu bệnh hại cây trồng như các dòng vi khuẩn
Bacillus spp. v.v... Để thử nghiệm hiệu lực ức chế của vi khuẩn đối kháng đối với
Phytophthora palmivora trong điều kiện invitro chúng tôi đã lựa chọn nguồn vi
khuẩn Bacillus methylotrophicus nhằm đánh giá khả năng ức chế của vi khuẩn
này đối với P. palmivora gây bệnh chảy gôm cây sầu riêng. Thí nghiệm được tiến
hành như sau: cấy P. palmivora và vi khuẩn đối kháng B. methylotrophicus vào
môi trường PDA, theo dõi sự phát triển của Phytophthora palmivora trong 2, 4,
6, 8, 10 ngày với 2 công thức:
+ CT Đối chứng: Chỉ cấy P. palmivora
+ CT Thí nghiệm: Cấy P. palmivora và B. methylotrophicus (cấy 2 vạch) cách
3cm và cấy cùng thời điểm. Kết quả thể hiện ở bảng 4.17.
Bảng 4.17. Hiệu lực ức chế của vi khuẩn đối kháng Bacillus methylotrophicus
đến sự phát triển của Phytophthora palmivora
STT Công thức
1 Đối chứng
(chỉ cấy Phytophthora palmivora) 2 Cấy Phytophthora palmivora và
B.methylotrophicus (cấy 2 vạch cách 3cm và cấy cùng thời điểm)
LSD0,05
CV%
D:Đường kính tản nấm Phytophthora palmivora
H:Hiệu lực ức chế của vi khuẩn đối kháng Bacillus methylotrophicus đối với Phytophthora palmivora (%)
Qua bảng 4.17 cho thấy: Khi cấy 2 vạch vi khuẩn B. methylotrophicus cách 3 cm và cấy cùng thời điểm với P. palmivora thì vi khuẩn có hiệu lực ức chế rõ rệt đến sự sinh trưởng và phát triển của P. Palmivora thể hiện ở đường kính tản nấm công thức thí nghiệm thấp hơn nhiều so với công thức đối chứng. Tại thời điểm 2 ngày sau cấy hiệu lực của vi khuẩn B. methylotrophicus đối với P.
palmivora đã đạt 51,18%, sau đó tăng dần vào các ngày tiếp theo. Tại thời điểm 6 ngày sau cấy hiệu lực đạt 59,73% và cao nhất là vào thời điểm 10 ngày sau cấy, hiệu lực ức chế của vi khuẩn B. methylotrophicus đối với P. palmivora đạt giá trị 69,15%.
Như vậy vi khuẩn đối kháng B. methylotrophicus có hiệu lực ức chế tương
đối cao đối với Phytophthora palmivora khi cấy hai vạch đồng thời cách 3 cm và
cùng thời điểm.
(a) - đối kháng (b) - đối chứng
Hình 4.13. Hiệu lực ức chế của vi khuẩn đối kháng B.
methylotrophicus đến Phytophthora palmivora (sau 10 ngày)
4.3.2. Thử nghiệm hiệu lực ức chế của xạ khuẩn đối kháng Streptomyces
misionesis đến sự phát triển của Phytophthora palmivora
Ngoài nấm đối kháng Trichoderma sp., vi khuẩn đối kháng Bacillus thì các
loài xạ khuẩn cũng là những vi sinh vật đối kháng nấm bệnh được sử dụng rất nhiều trong phòng chống bệnh hại cây trồng. Để đánh giá khả năng ức chế của xạ
khuẩn Streptomyces misionesis đối với phytophthora palmivora gây bệnh chảy
gôm, thí nghiệm được tiến hành cấy phytophthora palmivora và xạ khuẩn đối
kháng streptomyces vào môi trường PDA, theo dõi sự phát triển của
Phytophthora palmivora trong 10 ngày ở điều kiện nhiệt độ phòng với 2 công thức sau:
+ CT ĐC: Đối chứng chỉ cấy Phytophthora palmivora
+ CT TN: Cấy P.palmivora và S. misionesis (cấy 2 vạch cách 3cm và cấy
cùng thời điểm).
59
Bảng 4.18. Hiệu lực ức chế của xạ khuẩn đối kháng Streptomyces misionesis
đến sự phát triển của Phytophthora palmivora
Đường kính tản nấm các ngày sau nuôi cấy (mm) STT Công thức
1
2
Đối chứng
(chỉ cấy Phytophthora palmivora) Cấy P.palmivora và S. misionesis
(cấy 2 vạch cách 3cm và cấy cùng thời điểm)
LSD 0,05
CV%
D:Đường kính tản nấm Phytophthora palmivora;
H:Hiệu lực ức chế của xạ khuẩn đối kháng đối với nấm Phytophthora palmivora (%)
60
Qua bảng 4.18 cho thấy: cũng tương tự như thí nghiệm với vi khuẩn đối
kháng. Khi cấy 2 vạch xạ khuẩn Streptomyces misionesis cách 3 cm và cấy cùng
thời điểm với P. palmivora thì xạ khuẩn cũng có hiệu lực ức chế rõ rệt đến sự
sinh trưởng và phát triển của P. Palmivora thể hiện ở đường kính tản nấm công
thức thí nghiệm thấp hơn nhiều so với công thức đối chứng. Xạ khuẩn
Streptomyces misionesis có khả năng đối kháng cao đối với P. palmivora, tại thời điểm 2 ngày sau cấy đường kính tản nấm công thức thí nghiệm chỉ đạt 12,60 mm
tương đương hiệu lực ức chế của xạ khuẩn Streptomyces misionesis đối với P.
palmivora đạt 50,39%, sau đó hiệu lực ức chế tăng dần vào các ngày tiếp theo. Tại thời điểm 8 ngày sau cấy đường kính tản nấm thí nghiệm chỉ là 18,80 mm hiệu lực đạt 75,13% và cao nhất là vào thời điểm 10 ngày sau cấy, hiệu lực ức
chế của xạ khuẩn Streptomyces misionesis đối với P. palmivora đạt giá trị
75,93%.
Có thể nói rằng thí nghiệm cho thấy xạ khuẩn đối kháng Streptomyces
misionesis có hiệu lực ức chế rất cao đối với Phytophthora palmivora khi cấy hai vạch đồng thời cách 3 cm và cùng thời điểm, khả năng ức chế của xạ khuẩn làm cho phytophthora palmivora mọc chậm và không có khả năng phát triển trên môi trường nuôi cấy nhân tạo.
(a)- Đối kháng (b)- Đối chứng
Hình 4.14. Hiệu lực ức chế của xạ khuẩn đối kháng Streptomyces misionesis đối với Phytophthora palmivora (sau 10 ngày)
4.3.3. Thử nghiệm hiệu lực ức chế của nấm đối kháng Trichoderma
harzianum đến sự phát triển của Phytophthora palmivora
Nấm đối kháng Trichoderma harzianum là một trong những loại chế phẩm
sinh học được quan tâm đến để phòng trừ các loại vi sinh vật gây bệnh trong đất
61
nói chung và Phytophthora nói riêng. Nấm Trichoderma biểu hiện tính đối kháng bằng cách ký sinh lên nấm gây bệnh hoặc tiết chất kháng sinh ức chế sự sinh trưởng, phát triển của nấm gây bệnh. Do đó 2 thí nghiệm đã được tiến hành để
đánh giá khả năng đối kháng của T. harzianum đối với tác nhân gây bệnh chảy
gôm P. palmivora trong điều kiện invitro như sau:
+ Khả năng ức chế của nấm Trichoderma harzianum đối với Phytophthora
palmivora bằng chất kháng sinh bay hơi: úp 2 đĩa có đường kính bằng nhau
cùng chứa môi trường PDA, một đĩa cấy nấm Trichoderma harzianum, đĩa kia
cấy nấm Phytophthora palmivora. Đối chứng là cặp Petri cấy nấm Phytophthora
palmivora. Theo dõi khả năng ức chế nấm gây bệnh bởi chất kháng sinh bay hơi
do nấm Trichoderma harzianum sinh ra. Kết quả trình bày ở bảng 4.19.
Bảng 4.19. Hiệu lực ức chế bằng kháng sinh bay hơi của nấm đối kháng
Trichoderma harzianum đến sự phát triển của Phytophthora palmivora
Đường kính tản nấm các ngày sau nuôi cấy (mm) STT Công thức 2 ngày 4 ngày 6 ngày
D H(%) D H(%) D H(%) 1 Đối chứng (chỉ cấy Phytophthora) 2 Cấy Phytophthora và Trichoderma (cấy cùng thời điểm và úp 2 đĩa nấm vào nhau)
3 CV%
4 LSD 0,05
Ghi chú: D – đường kính tản nấm; H – Hiệu quả ức chế (%)
Qua kết quả bảng 4.19 cho thấy, nấm đối kháng Trichoderma harzianum có
hiệu lực ức chế bằng kháng sinh bay hơi rõ rệt đến sự sinh trưởng và phát triển
của P. Palmivora thể hiện ở đường kính tản nấm công thức thí nghiệm thấp hơn
nhiều so với công thức đối chứng sau các ngày theo dõi thể hiện tại thời điểm 4
ngày sau cấy hiệu lực của nấm Trichoderma harzianum đối với P. palmivora đã
đạt 46,35% và tại thời điểm 6 ngày sau cấy hiệu lực đạt khá cao 65,81%.
62
Hình 4.15. Hiệu lực ức chế bằng kháng sinh bay hơi của nấm đối
kháng Trichoderma harzianum đến sự phát triển của
Phytophthora palmivora
(Sau 8 ngày TN)
+ Khả năng ký sinh trực tiếp của nấm Trichoderma harzianum
Cơ chế ký sinh: Trước tiên sợi nấm Trichoderma harzianum vây xung
quanh sợi nấm Phytophthora palmivora, sau đó các sợi nấm Trichoderma
harzianum thắt chặt lấy các sợi nấm Phytophthora palmivora, phá hủy, làm thủng
màng ngoài nấm Phytophthora palmivora, và cuối cùng nấm Trichoderma
harzianum xuyên qua sợi nấm gây nên sự phân hủy các chất nguyên sinh trong
sợi nấm này. Nấm Trichoderma harzianum muốn ký sinh trên nấm gây bệnh thì
các bào tử nấm Trichoderma harzianum khi nảy mầm phải được tiếp xúc với nấm
gây bệnh và tạo thể giác bám để bám chắc và xâm nhập vào trong thành tế bào vật chủ. Thí nghiệm thử khả năng đối kháng bằng cách ký sinh trực tiếp của
Trichoderma harzianum với nấm phytophthora palmivora đã được thực hiện với 4 công thức như sau:
+ CT ĐC: Công thức đối chứng P. palmivora
+ CT1: T. harzianum cấy trước P. palmivora 24 giờ
+ CT2: Cấy nấm đối kháng T. harzianum và P. palmivora cùng thời điểm
+ CT3: Cấy nấm đối kháng T. harzianum sau P. palmivora 24 giờ. Kết quả
được trình bày ở bảng 4.20.
Bảng 4.20. Hiệu lực ức chế bằng ký sinh trực tiếp của nấm đối kháng Trichoderma harzianum đến sự phát triển của Phytophthora
palmivora STT 1 2 3 4 5 6
Ghi chú: D – đường kính tản nấm; H – Hiệu quả ức chế (%)
Các chữ cái khác nhau đứng sau các chữ số chỉ sự sai khác có ý nghĩa theo phép thử của Duncan với độ tin cậy 95%.
- T: Trichoderma harzianum
- P: Phytophthora palmivora
- D: Đường kính tản Phytophthora palmivora
- H: Hiệu lực ức chế của nấm đối kháng đối với Phytophthora palmivora
Qua kết quả thể hiện ở bảng 4.20 cho thấy cả 3 công thức nấm đối kháng T.
harzianum đều có khả năng ức chế với P. palmivora tuy nhiên giữa các công thức
có sự khác nhau rõ rệt. Đối với CT1 hiệu lực ức chế của T. harzianum đạt cao
nhất tại thời điểm 2 ngày sau cấy là 100%, CT2 và CT3 chưa có sự ức chế nhiều của T. harzianum đối với P. palmivora thể hiện hiệu lực chỉ đạt 1,86%. Tại thời điểm 4 ngày sau nuôi cấy, CT1 vẫn cho hiệu quả ức chế cao nhất là 71,34%;
ở CT2 hiệu lực ức chế thấp hơn đạt 33,14% và CT3 cho hiệu lực ức chế thấp
nhất, hiệu lực chỉ đạt 25,28%. sau 6 ngày nuôi cấy thí nghiệm cho thấy khả năng
ức chế của nấm đối kháng T. harzianum đối với P.palmivora vẫn cao nhất tại CT1
hiệu lực đạt 83,70%, thấp nhất là CT3 hiệu lực chỉ đạt 51,44%, và công thức 2 hiệu lực 61,97%.
Từ kết quả thu được ở thí nghiệm đánh giá hiệu lực ức chế của nấm đối
kháng Trichoderma harzianum đối với P. palmivora gây bệnh chảy gôm sầu
riêng cho thấy cơ chế của nấm đối kháng nếu chiếm được chỗ trước trên môi trường nuôi cấy nhân tạo thì nấm đối kháng sẽ phát huy hết khả ăng ức chế, cạnh
tranh và chiếm chỗ nhanh chóng tiêu diệt được P. palmivora, vì vậy hiệu lực đối
kháng của nấm Trichoderma harzianum đối với P. palmivora sẽ đạt giá trị cao
nhất. Ngoài ra khả năng sinh kháng sinh bay hơi của nấm đối kháng cũng rất hiệu quả trong việc ức chế nấm gây bệnh. Chính vì vậy trong thực tế để phòng trừ
bệnh chảy gôm do P. palmivora gây ra chúng ta có thể xử lý nấm Trichoderma
harzianum lên cây trồng hiệu quả trước khi tác nhân gây bệnh xuất hiện.
a) CT1 b) CT2 c) CT3 d) CT ĐC
Hình 4.16. Hiệu lực ức chế bằng ký sinh trực tiếp của nấm đối kháng Trichoderma harzianum đến sự phát triển của Phytophthora
palmivora
(sau 4 ngày)
4.4. THỬ NGHIỆM HIỆU QUẢ CỦA CHẾ PHẨM NANO KIM LOẠI BẠC
(AG-H) ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN PHYTOPHTHORA
PALMIVORA GÂY BỆNH CHẢY GÔM HẠI THÂN CÂY SẦU RIÊNG
Hiện nay công nghệ nano đang là một lĩnh vực khoa học với tiềm năng ứng dụng to lớn trong đó có nông nghiệp, nhiều vật liệu nano thể hiện khả năng kháng nấm, đặc biệt là các nguyên tố kẽm, đồng và bạc. Trong đó hạt nano bạc có khả năng đề kháng với nhiều nấm bệnh trên thực vật, gây hại nhiều cây trồng nông nghiệp.Các nhà khoa học đã nghiên cứu và đã thử hoạt tính kháng nấm của nano kim loại bạc đối với một số loại nấm gây bệnh trên cây trồng. Tùy từng loại chủng nấm khác nhau mà hiệu lực kháng nấm khác nhau. Để đánh giá hiệu quả
và lựa chọn nồng độ thích hợp với Phytophthora palmivora gây bệnh chảy gôm
sầu riêng, tiến hành thử hiệu lực ở các nồng độ khác nhau của nano kim loại bạc (Ag-H) đối với tác nhân gây bệnh này.
Thí nghiệm được tiến hành với 6 công thức. Trong đó có 5 công thức xử lý nano bạc với các nồng độ 1ppm, 2ppm, 3ppm, 4ppm, 5ppm và một công thức đối chứng không xử lý. Chỉ tiêu theo dõi là đường kính tản nấm sau 2, 4, 6 ngày xử lý nano bạc. Kết quả thể hiện ở bảng 4.21.
Bảng 4.21. Thử nghiệm hiệu lực của nano kim loại bạc Ag-H đến sự sinh trưởng, phát triển Phytophthora palmivora gây bệnh chảy gôm
sầu riêng STT 1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 4.17. Thử nghiệm hiệu lực của nano kim loại bạc (Ag-H) đến sự sinh trưởng, phát triển Phytophthora palmivora (sau 4 ngày TN)
Từ kết quả bảng 4.21 cho thấy Nano bạc (Ag-H) ở các công thức đều có khả
năng ức chế đến sự phát triển của Phytophthora palmivora , khả năng ức chế
khác nhau ở các nồng độ thí nghiệm khác nhau. Sau 2 ngày theo dõi, ở tất cả các
nồng độ thí nghiệm từ 1ppm – 5ppm thì Phytophthora không phát triển, hiệu quả
ức chế đạt 100%. Sau 4 ngày thí nghiệm, ở nồng độ 1ppm và 2ppm
Phytophthora palmivora phát triển rất chậm, tản nấm mọc co cụm lại và cho thấy
hiệu quả ứcchế của nano bạc đạt 88,76 – 96,62% trong khi ở nồng độ từ 3ppm-
5ppm nấm bệnh không phát triển. Sau 6 ngày theo dõi thí nghiệm cho thấy ở công thức thí
nghiệm nồng độ nano bạc từ 3-5ppm vẫn cho hiệu quả ức chế cao nhất đạt từ 94,63-97,79% trong khi ở nồng độ 1ppm và 2 ppm hiệu quả đạt thấp hơn là 78,54-88,64%.
Qua thí nghiệm cho thấy khả năng ức chế của nano kim loại bạc là rất tốt
đối với tác nhân gây bệnh chảy gôm Phytophthora palmivora, có thể ứng dụng để
phòng trừ bệnh diện rộng ngoài đồng ruộng.
4.5. TH Tó thể ứng dụng để phòng trPHYTOPHTHORA PALMIVORA
BYTOPHTHORA PALMIVORAhòng trừ bệnh diện rộng n
Trong nghiên cứu này, đã tiến hành lựa chọn và xử lý một số hoạt chất
thuốc trừ nấm lên môi trường PDA và tiến hành nuôi cấy Phytophthora
palmivora trên môi trường này trong tủ định ôn ở điều kiện nhiệt độ 28°C nhằm đánh giá khả năng ức chế của chúng trong điều kiện invitro. Có 5 loại thuốc
phòng trừ nấm được sử dụng để đánh giá hiệu lực ức chế đối với Phytophthora
palmivora gồm: Acrobat MZ 90/600 WP, Aliette 800WG, Ridomil Gold 68 WP, Agri-fos 400SL, Anvil 5SC. Kết quả thể hiện ở bảng 4.22:
Bảng 4.22. Khảo sát hiệu lực ức chế Phytophthora palmivora của 5 loại
thuốc: Acrobat MZ 90/600 WP, Aliette 800WG, Ridomil Gold 68 WP, Agri-fos 400SL, Anvil 5SC STT Tên thuốc 1 Đối chứng 2 Acrobat MZ 90/600 WP 3 Aliette 800WG 4 Ridomil gold 68WP 5 Agri-fos 400 SL 6 Anvil 5SC CV% LSD 0,05
Các chữ cái khác nhau đứng sau các chữ số chỉ sự sai khác có ý nghĩa theo phép thử của Duncan với độ tin cậy 95%.
Qua kết quả bảng 4.22 cho thấy: các thuốc thử nghiệm có hiệu lực ức chế
khác nhau đến sự phát triển của Phytophthora palmivora. Cụ thể:
Hai thuốc là Acrobat MZ 90/600 WP và Ridomil Gold 68 WG có hiệu lực
ức chế cao nhất đối với P. Palmivora làm cho chúng không phát triển được khi
cấy vào môi trường có pha thuốc sau 2 đến 8 ngày theo dõi, hiệu lực ức chế đạt