Phytophthora sp gây hại
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.3. Phương pháp thu thập mẫu bệnh, phân lập nấm và nghiên cứu một số đặc
đặc điểm chính của nấm
3.3.3.1. Phương pháp thu thập mẫu
a. Phương pháp thu thập mẫu bệnh
- Thu thập tất cả các loại triệu chứng điển hình bệnh hại, trên tất cả các bộ
phận của cây (lá, thân, rễ, hoa, quả). Các mẫu bệnh được đựng trong túi polyetylen sạch, ghi tên giống , ngày lấy mẫu, nơi thu mẫu. Sau khi thu thập được gửi hoặc mang ngay về phòng thí nghiệm để giám định.
- Rửa mẫu dưới vòi nước cho sạch bụi bẩn, bào tử nấm hoại sinh, thấm khô
bằng giấy vô trùng. Bảo quản mẫu bệnh trong tủ lạnh 4o C, sau đó tiến hành phân
lập nấm gây bệnh.
b. Phương pháp thu thập mẫu đất
Thu mẫu đất ở các vườn và các địa điểm cần thu mẫu, cho mẫu vào túi polyetylen sạch, ghi nhãn, tên, ngày thu, nơi thu mẫu.
3.3.3.2. Phương pháp phân lập nấm Phytophthora
Phương pháp phân lập Phytophthora từ đất và rễ bằng sử dụng mồi bẫy: Sử dụng mồi bẫy là cánh hoa và vỏ quả (Một số loại quả như : đu đủ, cacao, táo, lê
… thường ở giai đoạn quả xanh), (Erwin & Riberrio, 1996).
a. Phân lập nấm từ mẫu bệnh : Phytophthora sp.
Cách 1: Chọn mẫu bệnh có triệu chứng điển hình. Rửa mẫu bệnh sạch đất cát dưới vòi nước. Cắt chọn mảnh mô bệnh thích hợp. Khử trùng bề mặt các mảnh mô trên trong dung dịch khử trùng bề mặt bằng ethanol 70%. Thời gian khử trùng từ 30 giây – 1 phút, rửa lại mẫu bệnh bằng nước cất vô trùng 2 lần rồi thấm khô mẫu bệnh bằng giấy thấm vô trùng. Sau đó dùng dao mổ vô trùng cắt
thành các miếng mô bệnh có kích thước 2 – 3 mm2 (chứa cả phần mô bệnh và mô
khoẻ). Dùng panh vô trùng đặt các miếng mô bệnh trên vào môi trường PSM. Để
mẫu trong điều kiện nhiệt độ 25oC và ánh sáng thích hợp.
Theo dõi sự phát triển của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh phân lập. Khi quan sát thấy nấm đã phát triển từ mô bệnh ra môi trường, dùng que cấy nấm cắt lấy phần đỉnh sợi nấm chuyển sang môi trường thích hợp như PCA, PDA hoặc V8 – Juice. Toàn bộ việc cấy truyền được tiến hành trong điều kiện vô trùng và cách ly trong tủ cấy.
29
Cách 2: Bẫy nấm bằng cánh hoa hồng: Chọn mẫu bệnh có triệu chứng điển hình. Rửa mẫu bệnh sạch đất cát dưới vòi nước. Cắt chọn mảnh mô bệnh thích hợp. Khử trùng bề mặt các mảnh mô trên trong dung dịch khử trùng bề mặt bằng ethanol 70%. Thời gian khử trùng từ 30 giây – 1 phút, rửa lại mẫu bệnh bằng nước cất vô trùng 2 lần rồi thấm khô mẫu bệnh bằng giấy thấm vô trùng. Sau đó
dùng dao mổ vô trùng cắt thành các miếng mô bệnh có kích thước 5 mm2 (chứa
cả phần mô bệnh và mô khoẻ). Dùng panh vô trùng đặt các miếng mô bệnh trên vào cốc nước cất vô trùng, thả cánh hoa hồng khi cánh hoa hồng biểu hiện triệu chứng đã hình thành bọc bào tử, cấy đơn bào tử bằng phương pháp kim thủy tinh
lên môi trường đặc hiệu của nấm Phytophthora sp.
b. Phân lập nấm từ mẫu đất: Cho 5 gam đất vào cốc sạch, cho nước cất vào cốc và dùng cánh hoa hồng bẫy nấm như trên.
3.3.3.3. Phương pháp kích thích sinh bọc bào tử
* Dung dịch kích thích sinh bọc bào tử: Nước cất đã hấp vô trùng.
* Phương pháp kích thích sinh bọc bào tử:
- Cấy các mẫu nấm Phytophthora sp. trên môi trường PCA, V8-Juice trong
5-7 ngày, dùng dao cấy đã khử trùng cắt vào đĩa nấm thành những mẩu nhỏ và chuyển sang đĩa petri mới đã hấp khử trùng.
- Đổ dung dịch kích thích trên vào đĩa (20 ml/đĩa). Các đĩa được ủ trong tủ
ở 250C để hình thành bọc bào tử.
Chỉ tiêu theo dõi:
- Sợi nấm phồng
- Cách hình thành cành sinh bào tử
- Hình dạng, kích thước bào tử, sự rụng của bào tử và đường kính lỗ giải
phóng bào tử
- Sự hình thành, kích thước hậu bào tử.
Các mẫu nấm Phytophthora sp. được quan sát trên kính hiển vi Olympus.
3.3.3.4. Phương pháp bẫy nấm bằng cánh hoa hồng đỏ: cho mẫu bệnh hoặc đất vào cốc nước cất, khuấy, thả cánh hoa hồng vào cốc nước, hàng ngày quan sát cánh hoa hồng, khi cánh hoa hồng bị bệnh, khêu nấm lên lam, đậy lamen, đưa lên kính hiển vi quan sát bọc bào tử, bào tử động, sợi nấm, cành bào tử.
30
3.3.3.5. Phương pháp nghiên cứu quan sát mô tả đặc điểm hình thái nấm phytophthora sp.
Mô tả đặc điểm hình thái tản nấm trên môi trường nhân tạo, màu sắc tản nấm, dạng bào tử, dạng cành bào tử, núm, lỗ mở, cuống bào tử, cách mọc bào tử trên cành, bào tử hậu, điểm phồng của sợi nấm v.v
3.3.3.6. Phương pháp xác định tác nhân gây bệnh chảy gôm cây sầu riêng
a. Phương pháp xác định tác nhân gây bệnh theo phương pháp Koch’s Postulates
- Mô tả triệu chứng và nhận dạng, phân lập tác nhân gây bệnh và giám định.
- Lây bệnh nhân tạo tác nhân gây bệnh lên cây khoẻ, quan sát triệu chứng
bệnh biểu hiện có giống triệu chứng ban đầu không.
- Phân lập lại tác nhân gây bệnh được lấy từ nguồn đã lây nhiễm. Tác nhân
phân lập lại phải giống như tác nhân gây bệnh đã phân lập được lúc đầu.
- Nấm bệnh sau khi được phân lập và lây bệnh nhân tạo theo chu trình
Koch, cấy truyền trên môi trường PDA, hoặc PCA. Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc.
- Sau khi bào tử được hình thành, làm tiêu bản lam kính để quan sát đặc
điểm bào tử và đặc điểm hình thành bào tử dưới kính hiển vi quang học. Kết hợp các đặc điểm nuôi cấy và đặc hiểm hình thái sợi nấm, bào tử để định danh bước đầu đến mức chi hoặc loài.
b. Phương pháp xác định tác nhân gây bệnh chảy gôm bằng kỹ thuật sinh học phân tử (Phương pháp xác định và đánh giá mối quan hệ của nấm gây bệnh dựa vào các vùng liên gen ITS của cụm gen rDNA của Blair & cs., 2008).
Hiện nay, sự kết hợp giữa đặc điểm hình thái nấm và phân tích phân tử đóng vai trò quan trọng trong việc xác định chính xác tên loài. Trong các phương pháp nghiên cứu ở cấp độ phân tử áp dụng trong việc xác định tác nhân gây bệnh hại cây trồng thì việc phân tích trình tự vùng rDNA ITS (nuclear ribosomal internal transcribed spacers) được sử dụng phổ biến và có hiệu quả đối với tác nhân gây bệnh do nấm. Ngoài ra, việc phân tích bổ sung các vùng gene khác như translation elongation factor 1-alpha (TEF1-alpha), beta-tubulin (TUB)… là cần thiết trong trường hợp không thể xác định tên loài dựa trên vùng ITS.Phương pháp gồm các bước cơ bản sau:
31
- Chiết tách ADN của mẫu nấm
- Thực hiện phản ứng PCR nhân vùng ITS mục tiêu
- Kiểm tra và tinh sạch sản phẩm PCR sử dụng Kit chuyên dụng
- Giải trình tự sản phẩm PCR bằng máy giải trình tự gene
- Biên tập và phân tích trình tự bằng phần mềm như Mega, Mrbayes, RaxML.
Các bước tiến hành cụ thể :
- Nuôi cấy nấm Phytophthora sp. (Blair & cs., 2008)
- Chiết DNA từ nấm
ADN từ mẫu nấm nuôi cấy được chiết dùng kit Dneasy Plant Mini Kit của hãng Qiagen.
- Phản ứng PCR
Phản ứng PCR được thực hiện trên máy PCR với điều kiện sau: Khởi đầu
biến tính ở 940C trong 5 phút ; tiếp theo là 25 chu trình PCR với nhiệt độ gắn mồi
được tham khảo theo nhiệt độ biến tính trình bày ở bảng 1. Phản ứng được kết
thúc với 5 phút ở 720C.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1% được chuẩn bị bằng đệm TAE và chứa 0,5mg/ml ethidium bromide. Gel được chạy trên thiết bị điện di là Mini-Sub Cell (Biorad) với đệm TAE ở điện thế 100 V trong 30 phút. Bản gen được kiểm tra bằng hệ thống phân tích ảnh điện di.
- Mồi PCR
Các cặp mồi nhằm nhân các đoạn DNA ITS của nấm Phytophthora sp.
được trình bày chi tiết ở bảng sau :
Các mồi được sử dụng trong nghiên cứu (White & cs., 1990)
Mồi Trình tự (5’ – 3’)
ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGC
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
- Giải trình tự chuỗi ITS
Sản phẩm PCR được tinh sạch trực tiếp hoặc từ gel agarose dùng kit tinh chiết Pure LinkTM Quick Gel Extraction Kit (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Hàm lượng DNA được ước lượng bằng điện di agarose với lượng DNA tham khảo là 2 µl, 1 µl, 0,5 µl tương ứng với 0,5 µg ; 0,25µg DNA (Marker Generuler, Fermantas).
32
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được giải trình tự trực tiếp cả 2 chiều bằng mồi PCR.
Các chuỗi trình tự được biên tập bằng phần mềm Mega 7.0 và được so sánh với các chuỗi đã công bố từ trước bằng công cụ tìm kiếm BLAST tại NCBI (The
National Center for Biotechnology Information)
(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) hoặc tại cơ sở dữ liệu nấm Phytophthora
http://www.phytophthoradb.org/.
Phân tích chuỗi và xây dựng cây phả hệ được thực hiện bởi các phần mềm BioEdit 7.0 ; ClustalXl.83 ; Mega 7.0, RAxML, Mrbayes, PAUP...
3.3.3.7. Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm Phytophthora sp.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm Phytophthora sp.
Nấm Phytophthora sp. Được nuôi cấy trên đĩa petri có chứa các loại môi
trường khác nhau: CA (Cà rốt-agar), PCA (Khoai tây-cà rốt-agar), PDA (Khoai tây-đường dextrin-agar), Czapek, V8 Juice. Điều kiện pH môi trường 6,5, nhiệt
độ nuôi cấy 280C.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm Phytophthora sp.
Các ngưỡng nhiệt độ thí nghiệm: 100C, 150C, 200C, 250C, 300C, 350C,
400C. Các thí nghiệm trên môi trường V8-juice có pH 6,5.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của độ pH đến sự phát triển của nấm Phytophthora sp.
Các công thức thí nghiệm trên môi trường V8-juice với các ngưỡng pH
khác nhau: 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5 nhiệt độ nuôi cấy 280C.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng khác nhau đến sự phát triển của nấm Phytophthora sp.
+ Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường V8-juice với pH 6,5 và nhiệt
độ nuôi cấy 280C, gồm các công thức: tối liên tục, sáng liên tục, 12 giờ sáng xen
kẽ 12 giờ tối liên tục.
+ Mỗi công thức của các thí nghiệm trên được tiến hành 3 lần nhắc lại, 5
đĩa petri/1 lần nhắc.
33
+ Chỉ tiêu theo dõi chung cho các thí nghiệm trên: Theo dõi tốc độ phát triển của nấm ở các ngày thứ 1, 2, 3, 4, 5 sau khi cấy bằng cách đo đường kính tản nấm, mô tả đặc điểm và màu sắc sợi nấm.
- Thí nghiệm ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng đến sự hình thành bào tử nang của nấm Phytophthora sp.
Nấm Phytophthora sp. được nuôi cấy trên đĩa petri (môi trường PDA). Sau 6 ngày nuôi cấy, bổ sung nước cất khử trùng ngập các sợi nấm trên đĩa petri với 3 công thức thí nghiệm là sáng liên tục, 12giờ sáng xen kẽ 12 giờ tối liên tục, tối liên tục. Đặt ở nhiệt độ phòng 280C, thí nghiệm với 3 lần nhắc lại, 5 hộp petri/lần nhắc.
+ Chỉ tiêu theo dõi: số bọc bào tử/ml, đếm trên buồng đếm hồng cầu số bào
tử nang hình thành sau 2, 4, 6 ngày thí nghiệm.
Phương pháp tính mật độ bào tử
Rót 10ml nước cất khử trùng vào hộp petri có nấm thuần được nhân nuôi
trên môi trường dinh dưỡng PDA ở 280C. Dùng slide khử trùng cạo nhẹ bề mặt
thạch và lọc dung dich nấm qua màng lọc. Dùng pipet chuyển dung dịch nấm sang buồng đếm hồng cầu Neuvour. Mật độ bào tử /ml được tính theo công thức: A = (n x 10)/4 x D. Trong đó: A : số bào tử / ml, n: Số bào tử trung bình trong 5 ô đếm, D: nồng độ pha loãng.