Phản ứng ELISA trên nền mẫu chuẩn QC từ huyết thanh nguyên tới độ pha lỗng 1/512, màu vàng trong giếng phản ứng biểu hiện dương tính, màu trắng biểu hiện âm tính. Kết quả dựa vào giá trị ngưỡng OD450 ≥ 0,225 để kết luận mẫu dương tính.
Theo ISO-17025 việc thẩm định một quy trình được thực hiện trên mẫu điển hình, hoặc so sánh kết quả với 1 phương pháp khác tin cậy. Nền mẫu được pha lỗng thành các nồng độ khác nhau (nồng độ thấp, trung bình, cao) hoặc trong khoảng làm việc, mỗi nồng độ làm lặp lại ít nhất 6 lần, từ đĩ tính độ nhạy, độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính. Kết quả được trình bày Bảng 4.4.
Bảng 4.4. Tương quan giữa ELISA và VNT trên nền mẫu chuẩn QC
Độ pha lỗng mẫu chuẩn QC 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 Tổng số mẫu:
Độ nhạy của phản ứng trung hịa trên nền mẫu chuẩn QC: 100% Độ đặc hiệu của phản ứng trung hịa trên nền mẫu chuẩn QC: 100%
Ghi chú: (*) ngưỡng dương của phản ứng trung hịa ≥ 25
Kết quả trên cho thấy tại độ pha lỗng của mẫu chuẩn QC (quanlity control) 1/32 tương ứng kháng thể trung hịa đạt 25 thì ELISA dương tính 8/8 mẫu. Khi so sánh giá trị OD450 và hiệu giá kháng thể trung hịa thì cĩ tương quan tỷ lệ thuận (giá trị Pearson's R = 0,93) và cĩ ý nghĩa thống kê (p < 0,00001), hiệu giá kháng thể trung hịa từ 25 khi so sánh với phản ứng ELISA thì độ nhạy và độ đặc hiệu đều đạt 100%. Tuy nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu dựa trên nền mẫu chuẩn QC cao hơn độ nhạy và độ đặc hiệu mẫu thu thập thực địa. Mẫu thực địa tiềm ẩn yếu
tố khơng đặc hiệu: kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cĩ thể cĩ phản ứng nền khơng đặc hiệu bởi động vật thí nghiệm. Huyết thanh phản ứng bởi các epitope khơng phải epitope trung hịa (Chen, 2016). Khi dùng mẫu chuẩn QC làm nền mẫu thì lúc này thí nghiệm được so sánh chỉ cĩ 1 yếu tố thay đổi, đĩ là so sánh 2 phương pháp huyết thanh học (phương pháp VNT và ELISA) nên kết quả tin cậy hơn. Với các minh chứng trên, phản ứng trung hịa đủ điều kiện để ứng dụng nghiên cứu huyết thanh học.
4.3.3. Phản ứng trung hịa xác định kháng thể ở huyết thanh và sữa đầu
Ứng dụng phản ứng trung hịa xác định kháng thể trung hịa trong mẫu huyết thanh của nái mẹ, huyết thanh lợn con mới sinh 2-3 ngày tuổi và sữa đầu của mẹ. Kết quả ứng dụng phản ứng trung hịa trong khảo sát kháng thể của các cặp lợn nái- lợn con (sau bú sữa đầu) ở một số trang trại được trình bày ở Hình 4.10.
Ghi chú: hiệu giá kháng thể trung hịa ở nhĩm lợn nái và lợn con của chúng (A). Mẫu huyết thanh và sữa đầu được lấy ở cùng nhĩm lợn nái. Mẫu huyết thanh của lợn con thu thập 2 ngày sau khi bú sữa đầu (D2). Hiệu giá kháng thể trung hịa biểu diễn cho
từng nhĩm mẫu (B).