Độ pha lỗng mẫu chuẩn QC 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 Tổng số mẫu:
Độ nhạy của phản ứng trung hịa trên nền mẫu chuẩn QC: 100% Độ đặc hiệu của phản ứng trung hịa trên nền mẫu chuẩn QC: 100%
Ghi chú: (*) ngưỡng dương của phản ứng trung hịa ≥ 25
Kết quả trên cho thấy tại độ pha lỗng của mẫu chuẩn QC (quanlity control) 1/32 tương ứng kháng thể trung hịa đạt 25 thì ELISA dương tính 8/8 mẫu. Khi so sánh giá trị OD450 và hiệu giá kháng thể trung hịa thì cĩ tương quan tỷ lệ thuận (giá trị Pearson's R = 0,93) và cĩ ý nghĩa thống kê (p < 0,00001), hiệu giá kháng thể trung hịa từ 25 khi so sánh với phản ứng ELISA thì độ nhạy và độ đặc hiệu đều đạt 100%. Tuy nhiên, độ nhạy và độ đặc hiệu dựa trên nền mẫu chuẩn QC cao hơn độ nhạy và độ đặc hiệu mẫu thu thập thực địa. Mẫu thực địa tiềm ẩn yếu
tố khơng đặc hiệu: kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cĩ thể cĩ phản ứng nền khơng đặc hiệu bởi động vật thí nghiệm. Huyết thanh phản ứng bởi các epitope khơng phải epitope trung hịa (Chen, 2016). Khi dùng mẫu chuẩn QC làm nền mẫu thì lúc này thí nghiệm được so sánh chỉ cĩ 1 yếu tố thay đổi, đĩ là so sánh 2 phương pháp huyết thanh học (phương pháp VNT và ELISA) nên kết quả tin cậy hơn. Với các minh chứng trên, phản ứng trung hịa đủ điều kiện để ứng dụng nghiên cứu huyết thanh học.
4.3.3. Phản ứng trung hịa xác định kháng thể ở huyết thanh và sữa đầu
Ứng dụng phản ứng trung hịa xác định kháng thể trung hịa trong mẫu huyết thanh của nái mẹ, huyết thanh lợn con mới sinh 2-3 ngày tuổi và sữa đầu của mẹ. Kết quả ứng dụng phản ứng trung hịa trong khảo sát kháng thể của các cặp lợn nái- lợn con (sau bú sữa đầu) ở một số trang trại được trình bày ở Hình 4.10.
Ghi chú: hiệu giá kháng thể trung hịa ở nhĩm lợn nái và lợn con của chúng (A). Mẫu huyết thanh và sữa đầu được lấy ở cùng nhĩm lợn nái. Mẫu huyết thanh của lợn con thu thập 2 ngày sau khi bú sữa đầu (D2). Hiệu giá kháng thể trung hịa biểu diễn cho
từng nhĩm mẫu (B).
Hình 4.10A cho biết phản ứng trung hịa cĩ thể phát hiện được kháng thể trung hịa ở 2 loại mẫu khác nhau (huyết thanh- sữa đầu). Trong cùng nhĩm lợn, cĩ thể thấy kháng thể trong sữa non cao hơn hẳn so kháng thể trong huyết thanh mẹ (p < 0,05). Đặc điểm trên phù hợp với kết quả đã cơng bố (Clement & cs., 2016) và phản ánh đặc điểm sinh lý tiết sữa với hàm lượng IgG, IgM và IgA ở sữa đầu luơn cao hơn tối thiểu 2 lần so với hàm lượng trong máu lợn nái (Porter, 1969). Khi tổng hợp kết quả theo nhĩm lợn, dễ dàng thấy rằng phản ứng trung hịa mới thiết lập cịn phát hiện được sự biến động về hiệu giá kháng thể trung hịa ở mỗi nhĩm lợn (Hình 4.10B), đặc biệt là nhĩm lợn con theo mẹ với khoảng biến động từ 5 log2- 10 log2. Đây cĩ thể do lợn nái cĩ hàm lượng kháng thể thấp và/ hoặc lợn con tiếp nhận kháng thể truyền qua sữa đầu khơng đồng đều.
Như vậy, các kết quả nêu trên đã chứng tỏ phản ứng trung hịa được thiết lập thành cơng. Mặc dù vậy, cần ứng dụng phản ứng trung hịa với một dung lượng mẫu lớn hơn để tiếp tục đánh giá chất lượng cũng như hồn thiện các điểm yếu cĩ thể được phát hiện trong quá trình thực hiện.
4.4. ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG MIỄN DỊCH CHÉO GIỮA CÁC CHỦNG 4.4.1. Chế huyết thanh thỏ kháng các chủng PEDV thực địa
Xác định khả năng miễn dịch của mỗi chủng virus PEDV được thực hiện bằng cách tối miễn dịch trên thỏ thu huyết thanh miễn dịch và đánh giá hàm lượng kháng thể trung hịa. Kết quả được biểu diễn Hình 4.11
Hình 4.11 chỉ ra huyết thanh thỏ tối miễn dịch mỗi chủng PEDV được khảo sát huyết thanh định kỳ 7 ngày 1 lần, kết quả huyết thanh thỏ trước khi miễn dịch (ký hiệu D0) và sau miễn dịch 7 ngày (ký hiệu D7) kháng thể trung hịa âm tính. Kháng thể trung hịa bắt đầu xuất hiện từ D14 sau miễn dịch, huyết thanh thỏ D14, D21, D28, D35, D42 cả 5 chủng PEDV đều sinh kháng thể trung hịa, khơng cĩ sự khác nhau hiệu giá kháng thể giữa các chủng (p=0,075>0,05). Trong khi thỏ đối chứng cho kết quả âm tính. Đề cập thời gian xuất hiện kháng thể trung hịa trên lợn nhĩm tác giả (Diel & cs., 2016) cho biết kháng thể trung hịa bắt đầu xuất hiện trong huyết thanh lợn từ ngày thứ 7 đến ngày thứ 14 sau khi nhiễm PEDV và cao nhất 21 ngày, kéo dài tới 6 tháng. Trong thí nghiệm này, chúng tơi đã tạo được huyết thanh thỏ kháng mỗi chủng PEDV chứa kháng thể trung hịa PEDV, là nguyên liệu đánh giá khả năng kháng chéo giữa các chủng.
4.4.2. Đánh giá khả năng trung hịa chéo giữa các chủng PEDV
4.4.2.1. Khả năng trung hịa các chủng virus của huyết thanh kháng PEDV 0118
Các tài liệu mơ tả trước đây (Rweyemamu, 1978; Long, 2016; OIE, 2009) cho biết: phương pháp tin cậy nhất để đánh giá một chủng virus cĩ khả năng miễn dịch chéo với chủng virus khác là chỉ số miễn dịch bảo hộ chéo trên bản động vật, điều đĩ sẽ trả lời chính xác hiệu lực và tính kháng chéo tồn diện nhất. Nhưng liên quan an tồn sinh học và các vấn đề khác, nên việc sử dụng phương pháp huyết thanh học thay thế, được thực hiện trong phịng thí nghiệm (in vitro) được tổ chức OIE khuyến cáo nên dùng. Hình 4.12 (trang bên) mơ tả khả năng trung hịa chéo của huyết thanh thỏ kháng PEDV 0118 với các dịng PEDV thuộc genogroup G1 và genogroup G2.
Hình 4.12 cho thấy, bệnh tích tế bào (CPE - cytopathic effects) được quan sát qua nhuộm miễn dịch, CPE đặc trưng bởi tế bào nhiễm virus hợp nhất màng nguyên sinh chất thành cụm tế bào đa nhân hay gọi là thể hợp bào. Trong thí nghiệm này thấy rằng với cách đánh giá phản ứng trung hịa như đã thiết lập (phản ứng dương tính khi số cụm CPE giảm hơn 90% so với đối chứng ở mỗi nồng độ pha lỗng huyết thanh) thì hiệu giá kháng thể trung hịa của chủng PEDV 0118 được xác định là 256 khi phản ứng với các chủng thuộc nhĩm G2 (đồng nhĩm) trong khi phản ứng chéo với PED từ vắc xin (thuộc nhĩm G1) thấp hơn 2 lần.
Ghi chú: dương tính (+) , âm tính (-); HT: huyết thanh; PEDV VX: Virus PED cĩ nguồn gốc từ vắc xin nhược độc thuộc nhĩm G1; VNT- virus neutralizing test- hiệu giá kháng thể trung hịa -hiệu giá kháng thể trung hịa được xác định dương tính khi cĩ số tế bào nhiễm virus giảm hơn 90% so đối chứng âm.
Hình 4.12. Huyết thanh kháng PEDV 0118 phản ứng với các chủng PEDV
Từ năm 2013 vụ dịch PEDV bùng phát trở lại ở Mỹ là mốc thời gian xác định sự biến đổi, cĩ sự đa dạng kháng nguyên giữa dịng cổ điển và dịng mới nổi (Wang & cs., 2013). Vắc xin PED cĩ nguồn gốc từ các dịng PEDV cổ điển đã khơng bảo vệ hồn tồn được đàn lợn hoặc đã thất bại ở châu Á. Hơn nữa, nghiên cứu tính kháng chéo của kháng nguyên dựa trên các dịng mới nổi thấy rằng, chỉ cĩ sự bảo vệ chéo một phần giữa dịng cổ điển và dịng mới nổi cĩ độc lực cao (Chen, 2016). Trong nghiên cứu này, chúng tơi cũng thấy rằng cĩ sự khác biệt khả năng kháng chéo giữa kháng thể trung hịa của dịng mới nổi với dịng PEDV cổ điển, nhưng kháng chéo giữa chủng PEDV 0118 với các dịng trong cùng nhĩm G2 lại khơng cĩ sự khác biệt.
4.4.2.2. Kết quả hiệu giá kháng thể trung hịa chéo giữa các chủng PEDV
Sau khi thích nghi được PEDV thực địa trên tế bào Vero và xây dựng được phản ứng trung hịa với các chủng virus này, thì việc nghiên cứu đã đủ điều kiện để thực hiện phản ứng chéo huyết thanh học giữa các chủng PEDV. Phản ứng trung hịa chéo giúp đánh giá các chủng PEDV thuộc nhĩm G2 cĩ hay khơng mối quan hệ huyết thanh học với PEDV thuộc nhĩm G1 và ngược lại. Phản ứng trung hịa chéo được thực hiện giữa mỗi cặp đơi của huyết thanh kháng PEDV đồng chủng và PEDV dị chủng. Kết quả được trình bày Bảng 4.5.