Chúng tôi đã tiến hành giám định đặc điểm nuôi cấy trên các môi trường: nước thịt, thạch thường, MacConkey, thạch máu, endo, EMB, Kligler. Kết quả nuôi cấy cho thấy:
-Trên môi trường thạch thường, hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2- 3mm.
-Môi trường nước thịt, đục đều có lắng cặn màu tro nhạt ở dưới đáy, đôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân thối.
-Môi trường MacConkey, khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không trầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường.
-Môi trường thạch máu, khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt, gây dung huyết hoặc không gây dung huyết.
-Môi trường thạch brilliant green, thấy khuẩn lạc không màu trên nền vàng chanh.
-Môi trường simmon citrate có khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục. -Môi trường Endo, khuẩn lạc màu đỏ.
-Môi trường EMB, khuẩn lạc màu tím đen và môi trường SS, khuẩn lạc có màu đỏ.
Như vậy các chủng vi khuẩn E. coli phân lập đều có đặc điểm hình thái, bắt màu, tính chất khuẩn lạc mọc giống như Bertschinger et al., (1990), Nguyễn Như Thanh và cs. (1997) đã mô tả.
4.1.2. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hoá của vi khuẩn E. coli
Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của các chủng E. coli được lựa chọn để chế tạo vacxin phòng bệnh Phù đầu cho lợn đã bảo quản ở thạch lỏng glycerin và đông khô được thể hiện tại bảng 4.2.
Bảng 4.2. Một số đặc tính sinh hoá của vi khuẩn E. coli TT Chỉ tiêu kiểm TT Chỉ tiêu kiểm tra Số lượng mẫu Kết quả (+) Tỷ lệ (%) Kết quả 1 Indol 6 6 100,0 + 2 H2S 6 0 0,00 - 3 Di động 6 6 100,0 + 4 Lactose 6 6 100,0 + 5 Glucose 6 6 100.0 + 6 Galactose 6 6 100,0 + 7 Maltose 6 6 100,0 + 8 Fructose 6 6 100,0 + 9 Dulcitol 6 0 0,00 - 10 Manitol 6 6 100,0 + 11 Dextrose 6 6 100,0 + 12 Saccarose 6 0 0,00 -
Kết quả ở bàng 4.2. cho thấy: các chủng E. coli được chọn đều lên men 100% các loại đường lactose, galactose, fructose, manitol, dextrose; glucose, maltose; không có vi khuẩn E. coli nào lên men đường dulcitol và saccharose. Các chủng vi khuẩn E. coli có khả năng di động100%, các phản ứng sinh indol, phản ứng VP và phản ứng urea đều có tỷ lệ dương tính 100%.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương tự với tác giả Nguyễn Khả Ngự (2000), Nguyễn Ngọc Hải và cs. (2000) là vi khuẩn E. coli không lên men đường Dulcitol, có tính di động cao và các đặc tính sinh học khác. Kết quả chúng tôi cũng phù hợp với giám định đặc tính sinh hóa vi khuẩn E. coli của Bergey et al. (1994), vi khuẩn E. coli luôn có khả năng di động. Khác biệt với kết quả của Trần Thị Phương Nga (2006), sự lên men đường dulcitol (53,33%). Như vậy các chủng E. coli phân lập được đều có những đặc tính sinh hóa thông thường của vi khuẩn E. coli.
4.1.3. Kết quả kiểm tra serotype kháng nguyên O của vi khuẩn E. coli
Kiểm tra xác định serotyp kháng nguyên O của các chủng E. coli lựa chọn để chế tạo vaccine phòng bệnh Phù đầu sau một thời gian dài bảo quản trong thạch lỏng glycerin, xem mức độ ổn định của cấu trúc kháng nguyên O.
Kết quả kiểm tra cấu trúc kháng nguyên O của các chủng E.coli được lựa chọn để chế tạo vaccine phòng bệnh Phù đầu cho lợn đã bảo quản ở thạch lỏng Glycerin và đông khô thể hiện tại bảng 4.3.
Bảng 4.3. Serotyp kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn E. coli nghiên cứu
TT Serotyp O Kết quả Số chủng dương tính Ký hiệu chủng 1 O164 1 P1 2 O44 1 P2 3 O169/O141 1 P3 4 O127a 1 P4 5 O169/O149 1 P5 6 O166/O149 1 P6 7 O125 0 8 O28ac 0 9 O143 0 10 O63 0 11 KXĐ 0 Cộng 6
Chúng tôi đã tiến hành xác định serotyp kháng nguyên O của các chủng E. coli lựa chọn để chế tạo vaccine phòng bệnh Phù đầu cho lợn đã bảo quản ở thạch lỏng glycerin và đông khô được thể hiện tại bảng 4.3 cho thấy: Cả 6 chủng
E. coli lựa chọn để chế tạo vaccine đều có cấu trúc kháng nguyên O ổn định sau khi lưu giữ sau thời gian dài ở thạch lỏng glycerin và đông khô.
4.1.4. Kết quả kiểm tra các gen quy định sinh tổng hợp các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli của vi khuẩn E. coli
Kết quả kiểm tra các gen quy định sinh tổng hợp các yếu tố gây bệnh của các chủng E.coli được lựa chọn để chế tạo vaccine phòng bệnh Phù đầu cho lợn đã bảo quản ở thạch lỏng glycerin và đông khô được thể hiện tại bảng 4.4.
Bảng 4.4. Tỷ lệ các chủng vi khuẩn E. coli mang các gen quy định sinh tổng hợp các yếu tố gây bệnh
Các yếu tố gây bệnh
Số chủng mang gen quy định sinh tổng hợp các yếu tố gây bệnh Số chủng dương tính/ Tổng số chủng kiểm tra Tỷ lệ (%) Yếu tố bám dính F4 2/6 33,33 F18 4/6 66,67 Độc tố STa 5/6 83,33 STb 3/6 50.00 LT 1/6 16,67 VT2e 3/6 50,00
Kết quả thể hiện tại bảng 4.4. cho thấy: Cả 6 chủng E. coli lựa chọn để chế tạo vaccine đều có mang gen quy định sinh tổng hợp các yếu tố gây có tỷ lệ khác nhau, độc tố Sta có tỉ lệ cao nhất là 83,33%, độc tố LT có tỷ lệ thấp nhất là 16,67%. 4.1.5. Kết quả kiểm tra độc lực của các chủng vi khuẩn E. coli trên chuột bạch
Vi khuẩn E. coli cũng như các loại vi khuẩn đường ruột khác có rất nhiều Serotype. Độc lực của chúng phụ thuộc vào các yếu tố gây bệnh ở mỗi Serotype, quyết định thể bệnh chúng tạo ra.
Để làm rõ hơn các vai trò gây bệnh của các chủng vi khuẩn E. coli phân lập được, sau khi đã nghiên cứu các đặc tính hình thái, nuôi cấy, tính chất sinh hóa cũng như xác định các yếu tố gây bệnh của chúng. Chúng tôi đã chọn một số chủng vi khuẩn E. coli có các yếu tố gây bệnh điển hình để xác định độc lực trên chuột bạch, từ đó làm cơ sở cho việc xác định khả năng ổn định độc lực của các chủng được chọn chế vaccine phòng bệnh lưu giữ ở thạch lỏng và đông khô. Kết quả kiểm tra được trình bày ở bảng 4.5.
Bảng 4.5. Độc lực của 10 chủng vi khuẩn E. coli trên chuột bạch TT TT Ký hiệu chủng Số chuột tiêm Liều tiêm (1con) Số chuột chết Thời gian chết (giờ) Tỷ lệ chết (%) 1 P1 2 0,2ml 2 17-24 100 2 P2 2 0,2ml 2 17 100 3 P3 2 0,2ml 1 24 100 4 P4 2 0,2ml 2 17-18 100 5 P5 2 0,2ml 1 17-18 100
Qua bảng trên cho thấy, các chủng vi khuẩn E. coli được chọn thử độc lực, tất cả đều có độc lực giết chuột. Trong đó có 6/6 chủng giết chết cả 2/2 chuột trong vòng 17-24giờ (100,0%).
Bệnh tích mổ khám chuột bị chết cho thấy: Bụng chướng to, đường tiêu hóa chướng hơi nặng và có mùi chua thối, phổi viêm sưng và xuất huyết bề mặt, gan sưng cứng tụ huyết, ruột xuất huyết.
Tất cả chuột chết mổ khám kiểm tra bệnh tích đều phân lập được vi khuẩn
E. coli thuần từ máu tim.
So sánh kết quả nghiên cứu của chúng tôi, có thấp hơn so với kết quả của Nguyễn Khả Ngự (2000), khi thử độc lực của E. coli phân lập từ lợn phù đầu gây chết 100% số chuột gây bệnh trong vòng 24- 96 giờ.
Từ các kết quả trên, 5 chủng vi khuẩn có độc lực mạnh nhất, gây chết 100% số chuột thí nghiệm trong thời gian từ (17- 24 giờ) chọn để chế vaccine rất ổn định về cấu trúc kháng nguyên và độc lực.
4.2. QUY TRÌNH SẢN XUẤT VACCINE THEO QUY MÔ CÔNG NGHIỆP Chúng tôi đã tham gia sản xuất vaccine vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng Chúng tôi đã tham gia sản xuất vaccine vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh Phù đầu lợn theo quy mô công nghiệp.
Kết quả chế tạo vaccine vô hoạt keo phèn phòng bệnh Phù đầu cho lợn ở các lứa tuổi tại trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin thuộc Công ty CP Đức Hạnh Marphavet với sự tham gia của các cán bộ nhân viên xưởng vaccine vi khuẩn tại công ty.
4.2.1. Giống vi khuẩn E. coli để sản xuất vaccine
Chúng tôi sử dụng bộ giống vi khuẩn E. coli lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vaccine.
Bộ giống vi khuẩn E. coli có kháng nguyên tính cao, ổn định, chủng vi khuẩn có độc lực cao và mang đủ các yếu tố gây bệnh để được sử dụng trong việc chế tạo vaccine vô hoạt có bổ trợ keo phèn đủ đảm bảo tiêm 1 mũi phòng được bệnh Phù đầu do vi khuẩn E. coli gây ra ở lợn.
4.2.2. Nhân giống vi khuẩn E. coli trên môi trường thạch máu.
Vi khuẩn giống E. coli được bảo quản ở thạch lỏng glycerin, được cấy lên thạch , mỗi giống cấy lên 1 đĩa thạch máu nuôi trong tủ ấm 37oC với thời gian là 24 giờ.
Kiểm tra thuần: Khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần kiểm tra được tiến hành phiết lên phiến kính, cố định, rồi nhuộm theo phương pháp nhuộm Gram. Kiểm tra hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần.
Sau đó, chúng tôi cấy nhân giống bộ giống vi khuẩn E. coli ra nhiều đĩa đĩa thạch máu nuôi trong tủ ấm 37oC với thời gian là 24 giờ.