Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.1. Địa điểm nghiên cứu
- Trung tâm nghiên cứu phát triển vaccine thuộc Công ty CP Đức Hạnh Marphavet.
- Nhà máy sản xuất vaccine theo tiêu chuẩn WHO thuộc Công ty CP Đức Hạnh Marphavet.
- Học viện Nông nghiệp Việt nam. 3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Thời gian từ tháng 10/2016 đến tháng 10/2017 3.3. NGUYÊN LIỆU DÙNG CHO NGHIÊN CỨU
3.3.1. Vi khuẩn sử dụng chế tạo vaccine vô hoạt phòng bệnh Phù đầu lợn lưu giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vaccine giữ tại Trung tâm nghiên cứu phát triển vaccine
3.3.2. Môi trường, hóa chất dùng trong nghiên cứu, sản xuất vaccine vô hoạt phòng bệnh Phù đầu lợn phòng bệnh Phù đầu lợn
* Các loại hóa chất, môi trường dùng để nuôi cấy và giám định các loại vi khuẩn E. coli bao gồm:
- Môi trường thạch, nước thịt: + Thạch máu (Blood Agar Base).
+ Môi trường BPW, RV, Mac Conkey, Môi trường thạch CHROMTM
Salmonella và thạch DHL.
+ Môi trường TSI, LIM và môi trường Malonate dùng để giám định vi khuẩn.
+ Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) dùng để định typ và giữ giống vi khuẩn.
+ Môi trường nước thịt: Nước thịt thường (Nutrient broth), nước thịt BHI (Brain Heart Infusion broth), nước thịt TSB (Tryptic Soy Broth), nước thịt TPB (Tryptone Photphat Broth),…
- Môi trường, hóa chất xác định các đặc tính sinh hóa: oxidase, catalase, indol, urease, ONPG; Các loại đường: glucose, lactose, maltose, mannitol, arabinose, trehalose, raffinose,…
- Kháng huyết thanh chuẩn (do hãng Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Nhật Bản sản xuất) dùng để định typ kháng nguyên vi khuẩn.
* Các loại hóa chất dùng trong phản ứng PCR
Bao gồm các hóa chất dùng trong phản ứng PCR để giám định, xác định serotype và yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli như: PCR buffer, dNTPs, primers, Taq DNA polymerase, DNA ladder, loading dye,…
* Giống vi khuẩn
Các chủng vi khuẩn dùng làm đối chứng dương gồm: E. coli do Viện Thú y Nhật Bản, Úc cung cấp.
* Động vật thí nghiệm
- Chuột nhắt trắng khỏe mạnh (18-20 g/con).
- Lợn 35 – 40 ngày tuổi, khỏe mạnh, chưa được tiêm vaccine phòng bệnh phù đầu.
* Trang thiết bị phòng thí nghiệm
Bao gồm các dụng cụ thí nghiệm, buồng cấy, nồi hấp vô trùng, tủ sấy, máy ly tâm, máy nhân gen PCR, máy điện di sản phẩm PCR,…
3.3.3. Trang thiết bị dụng cụ thí nghiệm
- Các máy móc, dụng cụ dùng trong phòng thí nghiệm, các hoá chất dùng để sát trùng, tiêu độc, rửa dụng cụ,... như PCR, RT-PCR; ELISA,...
- Dây chuyền công nghệ chế tạo vaccine quy mô công nghiệp như bộ máy lên men sục khí 15 lít và 120 lit SATORIUS của CHLB Đức; hệ thống ra chai tự động của Ý,...
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Xác định sự ổn định về đặc tính sinh vật hoá học, về cấu trúc kháng nguyên và các yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn E. coli đã được lựa chọn để chế tạo vaccine phòng bệnh phù đầu cho lợn.
- Quy trình sản xuất vaccine vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh Phù đầu lợn theo quy mô công nghiệp.
- Kiểm nghiệm vaccine vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh Phù đầu lợn theo quy mô công nghiệp.
- Quy trình sử dụng và bảo quản vaccine vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh Phù đầu lợn theo quy mô công nghiệp.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phương pháp giám định vi khuẩn 3.5.1. Phương pháp giám định vi khuẩn
Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật PCR
Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên động vật thí nghiệm Phương pháp chế tạo vaccine phòng bệnh phù đầu lợn
Phương pháp kiểm nghiệm vaccine phù đầu lợn
Các phương pháp nuôi cấy và giám định vi khuẩn được thực hiện theo quy trình nghiên cứu thường quy của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y.
- Phương pháp giám định đặc tính, serotyp, yếu tố gây bệnh, độc lực của vi khuẩn E. coli theo phương pháp thường quy và phương pháp sinh học phân tử (PCR, PFGE) của chuyên gia Nhật bản và Australia hướng dẫn có cải tiến phù hợp như:
+ Sử dụng các phương pháp phân lập vi khuẩn, thử phản ứng sinh vật hoá học thường quy trong phòng thí nghiệm.
+ Xác định yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập bằng 1 số phương pháp sinh học phân tử (PCR, SDS-PAGE), in vitro và in vivo.
+ Sử dụng các phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật mới như PCR, điện di để xác định cấu trúc kháng nguyên, sản sinh độc tố... của vi khuẩn E. coli.
3.5.2. Phương pháp giám định vi khuẩn
Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật PCR
Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên động vật thí nghiệm Phương pháp chế tạo vaccine phòng bệnh phù đầu lợn
Phương pháp kiểm nghiệm vaccine phù đầu lợn
+ Xác định các yếu tố gây bệnh (độc tố và yếu tố bám dính) của vi khuẩn E. coli bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction).
Bảng 3.1. Các cặp mồi do công ty Fermentas cung cấp để xác định các yếu tố độc lực và bám dính của vi khuẩn E. coli
Yếu tố gây bệnh Ký hiệu mồi Trình tự DNA Kích thước sp (bp)
STa STa-1 5’ TCT TTC CCC TCT TTT AGT CAG 3’ 166
STa-2 5’ ACA GGC AGG ATT ACA ACA AAG 3’
STb STb-1 5’ ATC GCA TTT CTT CTT GCA TC 3’ 172
STb-2 5’ GGG CGC CAA AGC ATG CTC C 3’
LT LTa-1 5’ GGC GAC AGA TTA TAC CGT GC 3’ 696
LTa-2 5’ CCG AAT TCT GTT ATA TAT GTC 3’
F4 F4-Fw 5’ GGT GAT TTC AAT GGT TCG 3’ 601
F4-Rv 5’ ATT GCT ACG TTC AGC GGA GCG 3’
F18 FedA-1 5’ GTG AAA AGA CTA GTG TTT ATT TC 3’ 510
FedA-2 5’ CTT GTA AGT AAC CGC GTA AGC 3’
VT2e VT2-Fw 5’ CTT GGG TAT CCT ATT CCC GG 3’ 482
VT2-Rv 5’ CTG CTG TGA CAG TGA CAA AAC GC 3’
3.5.3. Phương pháp giám định vi khuẩn
Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật PCR
Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên động vật thí nghiệm Phương pháp chế tạo vaccine phòng bệnh phù đầu lợn
Phương pháp kiểm nghiệm vaccine phù đầu lợn
Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E. coli nghiên cứu trên chuột nhắt trắng theo phương pháp của Carter (1995).
3.5.4. Phương pháp giám định vi khuẩn
Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật PCR
Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên động vật thí nghiệm Phương pháp chế tạo vaccine phòng bệnh phù đầu lợn
Phương pháp kiểm nghiệm vaccine phù đầu lợn
+ Chủng vi khuẩn E. coli lựa chọn để chế tạo thử nghiệm vaccine phòng bệnh phù đầu cho lợn là các chủng vi khuẩn E. coli thuộc serotype đặc trưng, mang đầy đủ các yếu tố gây bệnh và có độc lực cao để sử dụng làm giống chế tạo thử nghiệm vaccine phòng bệnh phù đầu cho lợn.
+ Phương pháp chế tạo thử nghiệm vaccine:
Vaccine được chế tạo thử nghiệm theo quy trình sản xuất vaccine vô hoạt toàn khuẩn có bổ trợ keo phèn, bằng phương pháp lên men sục khí tại Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y. Quy trình tóm tắt được trình bày ở hình 3.2.
+ Kiểm tra vô trùng, an toàn và hiệu lực của vacxin chế tạo được: Do hiện nay chưa có quy trình kiểm nghiệm riêng cho vacxin phù đầu có bổ trợ keo phèn, nên vaccine sau khi chế tạo được tiến hành kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn 10 TCN 160-92 và 10 TCN 161-92 (2003) đối với vaccine vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu (Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương I).
Trong các phương pháp nuôi cấy chế tạo canh trùng để chế vaccine, chúng tôi sẽ lựa chọn và sử dụng các phương pháp nuôi cấy vi khuẩn E. coli phù hợp, thời gian nuôi cấy, môi trường nuôi cấy tối ưu để tạo được canh trùng có số lượng kháng nguyên cao nhất trong 1 ml để có được vaccine có liều tiêm ít nhất (liều tiêm vaccine 1ml/mũi tiêm) thuận lợi nhất cho người sử dụng vaccine.
Chúng tôi sẽ sử dụng công nghệ chế tạo vaccine vô hoạt toàn khuẩn có bổ trợ keo phèn với công nghệ lên men sục khí. Công nghệ chế tạo vaccine của đề tài có thể tóm tắt sơ đồ chế tạo vaccine đa giá như sau (trang bên) .
3.5.5. Phương pháp giám định vi khuẩn
Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật PCR
Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên động vật thí nghiệm Phương pháp chế tạo vaccine phòng bệnh phù đầu lợn
Phương pháp kiểm nghiệm vaccine phù đầu lợn
Vaccine đa giá vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh phù đầu do vi khuẩn E. coli dung huyết gây ra ở lợn sau khi chế tạo phải được kiểm nghiệm gồm:kiểm tra vô trùng, an toàn và hiệu lực của vaccine như sau:
Các bước kiểm tra vô trùng như sau: Từ mỗi lô vaccine, lấy ra 5 chai theo phương pháp ngẫu nhiên, lắc đều, dùng xi lanh nhựa vô trùng hút 0,2ml vaccine, nhỏ vào các ống môi trường thạch thường, thạch máu, thạch macconkey và BHI broth.
* Kiểm tra an toàn vaccine trên động vật a. Kiểm tra an toàn vaccine trên chuột nhắt trắng
Sơ đồ 4.1. Quy trình sản xuất vaccine vô hoạt phù đầu lợn có bổ trợ keo phèn
Nguồn: Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia Giống vi khuẩn: E.coli;
Thạch máu
Giống nhỏ: BHI, TPB
Giống sản xuất: BHI; TPB
Lên men sục khí: TPB
Vô hoạt bằng formol 0,5%
Trộn KN E. coli + keo phèn 20%
Ra chai, dán nhãn Thành phẩm
Kiểm tra thuần khiết Kiểm tra thuần khiết
Đếm số và kiểm tra thuần khiết Kiểm tra vô trùng
Kiểm tra thuần khiết
Đối với mỗi lô vaccine: Chọn 10 chuột nhắt trắng khỏe mạnh, chia làm 2 lô, mỗi lô 5 con. Theo dõi cả 2 lô chuột thí nghiệm trong vòng 7 ngày. Đánh giá kết quả: vaccine an toàn 100% khi tất cả 15 chuột ở lô thí nghiệm và lô đối chứng sau thời gian theo dõi 7 ngày chuột sống khỏe mạnh, không con nào có biểu hiện phản ứng bất thường sau khi tiêm.
b. Kiểm tra an toàn vaccine trên lợn
Đối với mỗi lô vaccine: Dùng 5 lợn sau cai sữa, khoẻ mạnh. Mỗi lợn tiêm 4 ml vaccine (2 liều vaccine), tiêm dưới da sau hốc tai. Theo dõi lợn 7 ngày sau khi tiêm vaccine.
Kết quả đánh giá: Vaccine an toàn 100% khi tất cả lợn được tiêm vaccine đều sống khỏe mạnh, không con nào có biểu hiện phản ứng bất thường sau khi tiêm.
* Kiểm tra hiệu lực bảo hộ của vaccine bằng phương pháp trọng tài
Để đánh giá hiệu lực của vaccine trên lợn, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm như sau:
+ Lô thí nghiệm gồm 15 lợn con 21 ngày tuổi thuộc 3 đàn khác nhau được tiêm vaccine E. coli với liều 1 ml/con vào dưới da gốc tai. Theo dõi các phản ứng cục bộ và toàn thân.
+ Lô đối chứng gồm 5 lợn 21 ngày tuổi không được tiêm vaccine.
Các lợn được nuôi trong các ô chuồng có điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng giống nhau. Sau 21 ngày, tiến hành công cường độc bằng hỗn hợp các chủng vi khuẩn đã dùng sản xuất vaccine. Theo dõi trong 10 ngày.
* Kiểm tra hiệu lực bảo hộ của vaccine trên chuột nhắt trắng.
Phương pháp thay thế (dùng chuột): mỗi lô vaccine chọn 10 chuột khoẻ, mỗi con tiêm 0,2 ml vaccine vào dưới da. Sau 21 ngày, chuột tiêm miễn dịch cùng với 5 chuột đối chứng đem thử thách với chủng cường độc với liều 10 LD50 cho 1 chuột. Toàn bộ chuột được theo dõi 10 ngày. Phải có 70-90% số chuột được bảo hộ. Trong khi đó các chuột đối chứng sau khi công cường độc đều chết 100% trong vòng 24- 48 giờ và đều phân lập được vi khuẩn E. coli từ máu tim các chuột chết.
3.6. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 3.6.1. Phân tích một số chỉ tiêu theo dõi
Số liệu thu được trong các thí nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học với sự hỗ trợ của phần mềm Excel…
- Tỷ lệ % khỏi bệnh = (Số con sống : Tổng số con điều trị) x 100 - Tỷ lệ % bảo hộ = (Số con sống : Tổng số con thí nghiệm) 100 - Công thức tính LD50 theo Reed & Muench (1938):
LgLD50 =LgA+(a-50)×d
a-b
Trong đó:
A: Nồng độ pha loãng gây chết sát trên 50% chuột. a: Tỷ lệ chuột chết do liều A gây ra (%).
b: Tỷ lệ chuột chết do liều B gây ra (%) (cộng dồn) với B là nồng độ pha loãng gây chết sát dưới 50% chuột.
d: Lg của nồng độ pha loãng.
- Số lượng vi khuẩn trong 1ml canh khuẩn được tính theo công thức dưới đây với đơn vị tính là CFU: X = a x N x 10
Trong đó:
X: Số lượng tế bào vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn N: Hệ số pha loãng.
a: Số khuẩn lạc trung bình có trong 0,1ml canh khuẩn pha loãng. 3.6.2. Xử lý số liệu
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.KẾT QUẢ KIỂM ĐỊNH GIỐNG E. COLI SẢN XUẤT VACCINE
Chúng tôi đã tiến hành xác định được sự ổn định các đặc tính sinh vật hoá học, cấu trúc kháng nguyên và các yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn
E. coli đã được lựa chọn. Các chủng vi khuẩn có độc lực cao, cấu trúc kháng nguyên ổn định và mang một số yếu tố gây bệnh để sản xuất vaccine phòng bệnh phù đầu lợn.
4.1.1. Kết quả kiểm tra một số đặc tính nuôi cấy
Kết quả kiểm tra một số đặc tính nuôi cấy của các chủng E. coli được lựa chọn để chế tạo vaccine phòng bệnh Phù đầu cho lợn đã bảo quản ở thạch lỏng glycerin và đông khô được thể hiện tại bảng 4.1.
Bảng 4.1 . Một số đặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn E. coli
Chỉ tiêu kiểm tra Số
chủng Đặc điểm
Kết quả (+)
Tỷ lệ (%)
Nước thịt thường 6 Mọc tốt, đục đều, lắng cặn
màu tro nhạt ở dưới đáy. 6 100,0
Thạch máu 6 Khuẩn lạc to, ướt lồi, viền
không gọn, màu xám nhạt. 6 100,0
Thạch thường 6
Khuẩn lạc tròn ướt, bóng láng không trong suốt, màu tro trắng nhạt hơi lồi.
6 100,0
Thạch macConkey 6
Khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường.
6 100,0
Thạch simmon citrat 6 Khuẩn lạc không màu trên
nền xanh lục 6 100,0
Thạch endo 6 Khuẩn lạc màu đỏ 6 100,0
Thạch SS 6 Khuẩn lạc có màu đỏ 6 100,0
Hình 4.1. Hình thái vi khuẩn E. coli mọc trên thạch máu
Bằng phương pháp làm tiêu bản, nhuộm Gram, quan sát trên kính hiển vi quang học, chúng tôi nhận thấy rằng, tất cả các chủng vi khuẩn bảo quản đều có hình thái, tính chất bắt màu đặc trưng. Vi khuẩn có dạng trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, bắt màu đỏ đều, Gram(-), không nha bào và giáp mô.
Chúng tôi đã tiến hành giám định đặc điểm nuôi cấy trên các môi trường: nước thịt, thạch thường, MacConkey, thạch máu, endo, EMB, Kligler. Kết quả nuôi cấy cho thấy:
-Trên môi trường thạch thường, hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2- 3mm.
-Môi trường nước thịt, đục đều có lắng cặn màu tro nhạt ở dưới đáy, đôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân thối.
-Môi trường MacConkey, khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không trầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường.
-Môi trường thạch máu, khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt, gây dung huyết hoặc không gây dung huyết.
-Môi trường thạch brilliant green, thấy khuẩn lạc không màu trên nền vàng chanh.
-Môi trường simmon citrate có khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục. -Môi trường Endo, khuẩn lạc màu đỏ.
-Môi trường EMB, khuẩn lạc màu tím đen và môi trường SS, khuẩn lạc có màu đỏ.
Như vậy các chủng vi khuẩn E. coli phân lập đều có đặc điểm hình thái, bắt màu, tính chất khuẩn lạc mọc giống như Bertschinger et al., (1990), Nguyễn Như Thanh và cs. (1997) đã mô tả.