Phần 3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp giám định vi khuẩn
Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật PCR
Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên động vật thí nghiệm Phương pháp chế tạo vaccine phòng bệnh phù đầu lợn
Phương pháp kiểm nghiệm vaccine phù đầu lợn
Các phương pháp nuôi cấy và giám định vi khuẩn được thực hiện theo quy trình nghiên cứu thường quy của Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y.
- Phương pháp giám định đặc tính, serotyp, yếu tố gây bệnh, độc lực của vi khuẩn E. coli theo phương pháp thường quy và phương pháp sinh học phân tử (PCR, PFGE) của chuyên gia Nhật bản và Australia hướng dẫn có cải tiến phù hợp như:
+ Sử dụng các phương pháp phân lập vi khuẩn, thử phản ứng sinh vật hoá học thường quy trong phòng thí nghiệm.
+ Xác định yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn phân lập bằng 1 số phương pháp sinh học phân tử (PCR, SDS-PAGE), in vitro và in vivo.
+ Sử dụng các phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật mới như PCR, điện di để xác định cấu trúc kháng nguyên, sản sinh độc tố... của vi khuẩn E. coli.
3.5.2. Phương pháp giám định vi khuẩn
Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật PCR
Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên động vật thí nghiệm Phương pháp chế tạo vaccine phòng bệnh phù đầu lợn
Phương pháp kiểm nghiệm vaccine phù đầu lợn
+ Xác định các yếu tố gây bệnh (độc tố và yếu tố bám dính) của vi khuẩn E. coli bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction).
Bảng 3.1. Các cặp mồi do công ty Fermentas cung cấp để xác định các yếu tố độc lực và bám dính của vi khuẩn E. coli
Yếu tố gây bệnh Ký hiệu mồi Trình tự DNA Kích thước sp (bp)
STa STa-1 5’ TCT TTC CCC TCT TTT AGT CAG 3’ 166
STa-2 5’ ACA GGC AGG ATT ACA ACA AAG 3’
STb STb-1 5’ ATC GCA TTT CTT CTT GCA TC 3’ 172
STb-2 5’ GGG CGC CAA AGC ATG CTC C 3’
LT LTa-1 5’ GGC GAC AGA TTA TAC CGT GC 3’ 696
LTa-2 5’ CCG AAT TCT GTT ATA TAT GTC 3’
F4 F4-Fw 5’ GGT GAT TTC AAT GGT TCG 3’ 601
F4-Rv 5’ ATT GCT ACG TTC AGC GGA GCG 3’
F18 FedA-1 5’ GTG AAA AGA CTA GTG TTT ATT TC 3’ 510
FedA-2 5’ CTT GTA AGT AAC CGC GTA AGC 3’
VT2e VT2-Fw 5’ CTT GGG TAT CCT ATT CCC GG 3’ 482
VT2-Rv 5’ CTG CTG TGA CAG TGA CAA AAC GC 3’
3.5.3. Phương pháp giám định vi khuẩn
Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật PCR
Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên động vật thí nghiệm Phương pháp chế tạo vaccine phòng bệnh phù đầu lợn
Phương pháp kiểm nghiệm vaccine phù đầu lợn
Xác định độc lực của các chủng vi khuẩn E. coli nghiên cứu trên chuột nhắt trắng theo phương pháp của Carter (1995).
3.5.4. Phương pháp giám định vi khuẩn
Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật PCR
Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên động vật thí nghiệm Phương pháp chế tạo vaccine phòng bệnh phù đầu lợn
Phương pháp kiểm nghiệm vaccine phù đầu lợn
+ Chủng vi khuẩn E. coli lựa chọn để chế tạo thử nghiệm vaccine phòng bệnh phù đầu cho lợn là các chủng vi khuẩn E. coli thuộc serotype đặc trưng, mang đầy đủ các yếu tố gây bệnh và có độc lực cao để sử dụng làm giống chế tạo thử nghiệm vaccine phòng bệnh phù đầu cho lợn.
+ Phương pháp chế tạo thử nghiệm vaccine:
Vaccine được chế tạo thử nghiệm theo quy trình sản xuất vaccine vô hoạt toàn khuẩn có bổ trợ keo phèn, bằng phương pháp lên men sục khí tại Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y. Quy trình tóm tắt được trình bày ở hình 3.2.
+ Kiểm tra vô trùng, an toàn và hiệu lực của vacxin chế tạo được: Do hiện nay chưa có quy trình kiểm nghiệm riêng cho vacxin phù đầu có bổ trợ keo phèn, nên vaccine sau khi chế tạo được tiến hành kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn 10 TCN 160-92 và 10 TCN 161-92 (2003) đối với vaccine vô hoạt có bổ trợ nhũ dầu (Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương I).
Trong các phương pháp nuôi cấy chế tạo canh trùng để chế vaccine, chúng tôi sẽ lựa chọn và sử dụng các phương pháp nuôi cấy vi khuẩn E. coli phù hợp, thời gian nuôi cấy, môi trường nuôi cấy tối ưu để tạo được canh trùng có số lượng kháng nguyên cao nhất trong 1 ml để có được vaccine có liều tiêm ít nhất (liều tiêm vaccine 1ml/mũi tiêm) thuận lợi nhất cho người sử dụng vaccine.
Chúng tôi sẽ sử dụng công nghệ chế tạo vaccine vô hoạt toàn khuẩn có bổ trợ keo phèn với công nghệ lên men sục khí. Công nghệ chế tạo vaccine của đề tài có thể tóm tắt sơ đồ chế tạo vaccine đa giá như sau (trang bên) .
3.5.5. Phương pháp giám định vi khuẩn
Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật PCR
Phương pháp kiểm tra độc lực của vi khuẩn trên động vật thí nghiệm Phương pháp chế tạo vaccine phòng bệnh phù đầu lợn
Phương pháp kiểm nghiệm vaccine phù đầu lợn
Vaccine đa giá vô hoạt có bổ trợ keo phèn phòng bệnh phù đầu do vi khuẩn E. coli dung huyết gây ra ở lợn sau khi chế tạo phải được kiểm nghiệm gồm:kiểm tra vô trùng, an toàn và hiệu lực của vaccine như sau:
Các bước kiểm tra vô trùng như sau: Từ mỗi lô vaccine, lấy ra 5 chai theo phương pháp ngẫu nhiên, lắc đều, dùng xi lanh nhựa vô trùng hút 0,2ml vaccine, nhỏ vào các ống môi trường thạch thường, thạch máu, thạch macconkey và BHI broth.
* Kiểm tra an toàn vaccine trên động vật a. Kiểm tra an toàn vaccine trên chuột nhắt trắng
Sơ đồ 4.1. Quy trình sản xuất vaccine vô hoạt phù đầu lợn có bổ trợ keo phèn
Nguồn: Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y Quốc gia Giống vi khuẩn: E.coli;
Thạch máu
Giống nhỏ: BHI, TPB
Giống sản xuất: BHI; TPB
Lên men sục khí: TPB
Vô hoạt bằng formol 0,5%
Trộn KN E. coli + keo phèn 20%
Ra chai, dán nhãn Thành phẩm
Kiểm tra thuần khiết Kiểm tra thuần khiết
Đếm số và kiểm tra thuần khiết Kiểm tra vô trùng
Kiểm tra thuần khiết
Đối với mỗi lô vaccine: Chọn 10 chuột nhắt trắng khỏe mạnh, chia làm 2 lô, mỗi lô 5 con. Theo dõi cả 2 lô chuột thí nghiệm trong vòng 7 ngày. Đánh giá kết quả: vaccine an toàn 100% khi tất cả 15 chuột ở lô thí nghiệm và lô đối chứng sau thời gian theo dõi 7 ngày chuột sống khỏe mạnh, không con nào có biểu hiện phản ứng bất thường sau khi tiêm.
b. Kiểm tra an toàn vaccine trên lợn
Đối với mỗi lô vaccine: Dùng 5 lợn sau cai sữa, khoẻ mạnh. Mỗi lợn tiêm 4 ml vaccine (2 liều vaccine), tiêm dưới da sau hốc tai. Theo dõi lợn 7 ngày sau khi tiêm vaccine.
Kết quả đánh giá: Vaccine an toàn 100% khi tất cả lợn được tiêm vaccine đều sống khỏe mạnh, không con nào có biểu hiện phản ứng bất thường sau khi tiêm.
* Kiểm tra hiệu lực bảo hộ của vaccine bằng phương pháp trọng tài
Để đánh giá hiệu lực của vaccine trên lợn, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm như sau:
+ Lô thí nghiệm gồm 15 lợn con 21 ngày tuổi thuộc 3 đàn khác nhau được tiêm vaccine E. coli với liều 1 ml/con vào dưới da gốc tai. Theo dõi các phản ứng cục bộ và toàn thân.
+ Lô đối chứng gồm 5 lợn 21 ngày tuổi không được tiêm vaccine.
Các lợn được nuôi trong các ô chuồng có điều kiện chăm sóc nuôi dưỡng giống nhau. Sau 21 ngày, tiến hành công cường độc bằng hỗn hợp các chủng vi khuẩn đã dùng sản xuất vaccine. Theo dõi trong 10 ngày.
* Kiểm tra hiệu lực bảo hộ của vaccine trên chuột nhắt trắng.
Phương pháp thay thế (dùng chuột): mỗi lô vaccine chọn 10 chuột khoẻ, mỗi con tiêm 0,2 ml vaccine vào dưới da. Sau 21 ngày, chuột tiêm miễn dịch cùng với 5 chuột đối chứng đem thử thách với chủng cường độc với liều 10 LD50 cho 1 chuột. Toàn bộ chuột được theo dõi 10 ngày. Phải có 70-90% số chuột được bảo hộ. Trong khi đó các chuột đối chứng sau khi công cường độc đều chết 100% trong vòng 24- 48 giờ và đều phân lập được vi khuẩn E. coli từ máu tim các chuột chết.
3.6. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 3.6.1. Phân tích một số chỉ tiêu theo dõi
Số liệu thu được trong các thí nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học với sự hỗ trợ của phần mềm Excel…
- Tỷ lệ % khỏi bệnh = (Số con sống : Tổng số con điều trị) x 100 - Tỷ lệ % bảo hộ = (Số con sống : Tổng số con thí nghiệm) 100 - Công thức tính LD50 theo Reed & Muench (1938):
LgLD50 =LgA+(a-50)×d
a-b
Trong đó:
A: Nồng độ pha loãng gây chết sát trên 50% chuột. a: Tỷ lệ chuột chết do liều A gây ra (%).
b: Tỷ lệ chuột chết do liều B gây ra (%) (cộng dồn) với B là nồng độ pha loãng gây chết sát dưới 50% chuột.
d: Lg của nồng độ pha loãng.
- Số lượng vi khuẩn trong 1ml canh khuẩn được tính theo công thức dưới đây với đơn vị tính là CFU: X = a x N x 10
Trong đó:
X: Số lượng tế bào vi khuẩn trung bình trong 1ml canh khuẩn N: Hệ số pha loãng.
a: Số khuẩn lạc trung bình có trong 0,1ml canh khuẩn pha loãng. 3.6.2. Xử lý số liệu
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.KẾT QUẢ KIỂM ĐỊNH GIỐNG E. COLI SẢN XUẤT VACCINE
Chúng tôi đã tiến hành xác định được sự ổn định các đặc tính sinh vật hoá học, cấu trúc kháng nguyên và các yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn
E. coli đã được lựa chọn. Các chủng vi khuẩn có độc lực cao, cấu trúc kháng nguyên ổn định và mang một số yếu tố gây bệnh để sản xuất vaccine phòng bệnh phù đầu lợn.
4.1.1. Kết quả kiểm tra một số đặc tính nuôi cấy
Kết quả kiểm tra một số đặc tính nuôi cấy của các chủng E. coli được lựa chọn để chế tạo vaccine phòng bệnh Phù đầu cho lợn đã bảo quản ở thạch lỏng glycerin và đông khô được thể hiện tại bảng 4.1.
Bảng 4.1 . Một số đặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn E. coli
Chỉ tiêu kiểm tra Số
chủng Đặc điểm
Kết quả (+)
Tỷ lệ (%)
Nước thịt thường 6 Mọc tốt, đục đều, lắng cặn
màu tro nhạt ở dưới đáy. 6 100,0
Thạch máu 6 Khuẩn lạc to, ướt lồi, viền
không gọn, màu xám nhạt. 6 100,0
Thạch thường 6
Khuẩn lạc tròn ướt, bóng láng không trong suốt, màu tro trắng nhạt hơi lồi.
6 100,0
Thạch macConkey 6
Khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường.
6 100,0
Thạch simmon citrat 6 Khuẩn lạc không màu trên
nền xanh lục 6 100,0
Thạch endo 6 Khuẩn lạc màu đỏ 6 100,0
Thạch SS 6 Khuẩn lạc có màu đỏ 6 100,0
Hình 4.1. Hình thái vi khuẩn E. coli mọc trên thạch máu
Bằng phương pháp làm tiêu bản, nhuộm Gram, quan sát trên kính hiển vi quang học, chúng tôi nhận thấy rằng, tất cả các chủng vi khuẩn bảo quản đều có hình thái, tính chất bắt màu đặc trưng. Vi khuẩn có dạng trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, bắt màu đỏ đều, Gram(-), không nha bào và giáp mô.
Chúng tôi đã tiến hành giám định đặc điểm nuôi cấy trên các môi trường: nước thịt, thạch thường, MacConkey, thạch máu, endo, EMB, Kligler. Kết quả nuôi cấy cho thấy:
-Trên môi trường thạch thường, hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính từ 2- 3mm.
-Môi trường nước thịt, đục đều có lắng cặn màu tro nhạt ở dưới đáy, đôi khi có màu xám nhạt, canh trùng có mùi phân thối.
-Môi trường MacConkey, khuẩn lạc có màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không trầy, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường.
-Môi trường thạch máu, khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn, màu xám nhạt, gây dung huyết hoặc không gây dung huyết.
-Môi trường thạch brilliant green, thấy khuẩn lạc không màu trên nền vàng chanh.
-Môi trường simmon citrate có khuẩn lạc không màu trên nền xanh lục. -Môi trường Endo, khuẩn lạc màu đỏ.
-Môi trường EMB, khuẩn lạc màu tím đen và môi trường SS, khuẩn lạc có màu đỏ.
Như vậy các chủng vi khuẩn E. coli phân lập đều có đặc điểm hình thái, bắt màu, tính chất khuẩn lạc mọc giống như Bertschinger et al., (1990), Nguyễn Như Thanh và cs. (1997) đã mô tả.
4.1.2. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hoá của vi khuẩn E. coli
Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của các chủng E. coli được lựa chọn để chế tạo vacxin phòng bệnh Phù đầu cho lợn đã bảo quản ở thạch lỏng glycerin và đông khô được thể hiện tại bảng 4.2.
Bảng 4.2. Một số đặc tính sinh hoá của vi khuẩn E. coli TT Chỉ tiêu kiểm TT Chỉ tiêu kiểm tra Số lượng mẫu Kết quả (+) Tỷ lệ (%) Kết quả 1 Indol 6 6 100,0 + 2 H2S 6 0 0,00 - 3 Di động 6 6 100,0 + 4 Lactose 6 6 100,0 + 5 Glucose 6 6 100.0 + 6 Galactose 6 6 100,0 + 7 Maltose 6 6 100,0 + 8 Fructose 6 6 100,0 + 9 Dulcitol 6 0 0,00 - 10 Manitol 6 6 100,0 + 11 Dextrose 6 6 100,0 + 12 Saccarose 6 0 0,00 -
Kết quả ở bàng 4.2. cho thấy: các chủng E. coli được chọn đều lên men 100% các loại đường lactose, galactose, fructose, manitol, dextrose; glucose, maltose; không có vi khuẩn E. coli nào lên men đường dulcitol và saccharose. Các chủng vi khuẩn E. coli có khả năng di động100%, các phản ứng sinh indol, phản ứng VP và phản ứng urea đều có tỷ lệ dương tính 100%.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương tự với tác giả Nguyễn Khả Ngự (2000), Nguyễn Ngọc Hải và cs. (2000) là vi khuẩn E. coli không lên men đường Dulcitol, có tính di động cao và các đặc tính sinh học khác. Kết quả chúng tôi cũng phù hợp với giám định đặc tính sinh hóa vi khuẩn E. coli của Bergey et al. (1994), vi khuẩn E. coli luôn có khả năng di động. Khác biệt với kết quả của Trần Thị Phương Nga (2006), sự lên men đường dulcitol (53,33%). Như vậy các chủng E. coli phân lập được đều có những đặc tính sinh hóa thông thường của vi khuẩn E. coli.
4.1.3. Kết quả kiểm tra serotype kháng nguyên O của vi khuẩn E. coli
Kiểm tra xác định serotyp kháng nguyên O của các chủng E. coli lựa chọn để chế tạo vaccine phòng bệnh Phù đầu sau một thời gian dài bảo quản trong thạch lỏng glycerin, xem mức độ ổn định của cấu trúc kháng nguyên O.
Kết quả kiểm tra cấu trúc kháng nguyên O của các chủng E.coli được lựa chọn để chế tạo vaccine phòng bệnh Phù đầu cho lợn đã bảo quản ở thạch lỏng Glycerin và đông khô thể hiện tại bảng 4.3.
Bảng 4.3. Serotyp kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn E. coli nghiên cứu
TT Serotyp O Kết quả Số chủng dương tính Ký hiệu chủng 1 O164 1 P1 2 O44 1 P2 3 O169/O141 1 P3 4 O127a 1 P4 5 O169/O149 1 P5 6 O166/O149 1 P6 7 O125 0 8 O28ac 0 9 O143 0 10 O63 0 11 KXĐ 0 Cộng 6
Chúng tôi đã tiến hành xác định serotyp kháng nguyên O của các chủng E. coli lựa chọn để chế tạo vaccine phòng bệnh Phù đầu cho lợn đã bảo quản ở thạch lỏng glycerin và đông khô được thể hiện tại bảng 4.3 cho thấy: Cả 6 chủng
E. coli lựa chọn để chế tạo vaccine đều có cấu trúc kháng nguyên O ổn định sau khi lưu giữ sau thời gian dài ở thạch lỏng glycerin và đông khô.
4.1.4. Kết quả kiểm tra các gen quy định sinh tổng hợp các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E. coli của vi khuẩn E. coli
Kết quả kiểm tra các gen quy định sinh tổng hợp các yếu tố gây bệnh của các chủng E.coli được lựa chọn để chế tạo vaccine phòng bệnh Phù đầu cho lợn