3.1. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Nghıên cứu được tıến hành từ 9/2018 đến 04/2019
3.2. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm bộ môn Bệnh lý khoa Thú Y, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Một số cơ sở chăn nuôi lợn trên địa bàn tỉnh Hưng Yên.
3.3. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu: Lợn siêu nạc các lứa tuổi, gồm các giống lợn: Landrace, Yorshire mắc nhóm bệnh phổi tại Văn Giang_ Hưng Yên.
3.4. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát tỷ lệ mắc bệnh phổi ở lợn siêu nạc.
- Tổng hợp và so sánh đặc điểm bệnh lý chủ yếu nhóm bệnh phổi ở lợn siêu nạc - Khảo sát một số chỉ tiêu huyết học của lợn siêu nạc mắc bệnh phổi.
3.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.2.1. Phương pháp xác định tỷ lệ lợn mắc bệnh phổi
Xác định lợn mắc bệnh phổi dựa vào triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đặc trưng. Tiến hành theo dõi thường xuyên, quan sát từng ô chuồng, kiểm tra từng cá thể để xem lợn mắc bệnh phổi hay có các bệnh khác không.
- Dựa vào các đặc điểm sau để nhận biết được lợn mắc bệnh phổi: Con vật ủ rũ, mệt mỏi, kém ăn, da xanh, khịt mũi thở khò khè, khó thở, hắt hơi, ho khan....
Sau khi theo dõi ghi chép vào nhật ký và ghi rõ số tai, số nái, nhóm tuổi, ô chuồng ngày tháng bị bệnh. Từ đó ta dự đoán ra các nguyên nhân bị bệnh và một số vấn đề cần lưu ý khi ta kết thúc thí nghiệm.
Số lợn con mắc bệnh phổi
Tỷ lệ mắc bệnh phổi = x 100
Xác lợn chết được mổ khám theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402: 2010 (Bộ khoa học & Công nghệ, 2010).
Mổ khám nhằm xác định được các biến đổi đại thể của các cơ quan, tổ chức của lợn mắc nhóm bệnh phổi, cần tiến hành mổ khám những lợn có biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh. Lợn bệnh cố định cẩn thận, tiến hành lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ. Lột da và bộc lộ xoang ngực, xoang bụng, tách các cơ quan nội tạng khỏi cơ thể để quan sát và chụp ảnh. Tiến hành thu mẫu các cơ quan như: phổi, tim, gan, lách, thận, ruột, hạch theo các mục đích nghiên cứu khác nhau. Một số mẫu bảo quản ngâm trong formol 10% (thời gian ngâm ít nhất 1 tuần) để làm tiêu bản vi thể (Cao Xuân Ngọc, 1997).
Phương pháp lấy bệnh phẩm
Dùng kéo cắt lấy một số bộ phạn mang bệnh tích đặc trưng ở cơ quan lợn mắc nhóm bệnh phổi như mẫu phổi, gan, ruột… (khoảng 3cm) rồi cho vào lọ chứa formol 10%.
3.4.2.3. Phương pháp làm và nhuộm tiêu bản vi thể
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể được lấy mẫu ngâm trong dung dịch formol 10% để làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh.
Tiêu bản vi thể được làm theo phương pháp của Prophet, E.B, 1992 bao gồm các bước: (1) Lấy mẫu; (2) khử nước, làm trong; (3) tẩm parafin; (4) đúc block; (5) cắt dán mảnh; (6) nhuộm Hematoxilin và Eosin; (7) gắn lamen, dán nhãn và đọc kết quả bằng kính hiển vi (Prophet and Pathology, 1992).
* Phương pháp làm tiêu bản bệnh lý
Từ những mẫu bệnh phẩm có các biến đổi đại thể được lấy mẫu ngâm trong formol 10% để làm tiêu bản vi thể. Cần tiến hành làm tiêu bản để xác định bệnh tích vi thể chủ yếu của bệnh. Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng paraffin, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE).
Mỗi lợn bệnh tiến hành lấy mẫu ở mỗi cơ quan hai miếng bệnh phẩm rồi đúc thành hai block. Mỗi block chúng tôi tiến hành cắt, nhuộm tiêu bản rồi chọn ra tiêu bản đẹp, sau đó tiến hành soi dưới kính hiển vi để đọc kết quả bệnh tích vi thể. Nếu block nào có hai tiêu bản có bệnh tích trở nên thì coi là dương tính.
Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất: lọ formol 10%, dao kéo, pank kẹp, cốc đựng hóa chất, phiến kính, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 37o
C, máy cắt mảnh microtom, nước ấm 48 – 52oC, xylem, paraffin, thuốc nhuộm hematoxylin, eosin…
Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là dạ dày, ruột, tim, gan, thận, lách… Cố định bệnh phẩm
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (Chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong formol)
Vùi bệnh phẩm
Tiến hành lần lượt các bước sau:
Rửa formol: Lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành từng miếng có chiều dài, rộng khoảng 4-5mm. Sau đó rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trọng 24h.
Khử nước: cho qua hệ thống gồm 3 lọ cồn
Cồn I: 3h
Cồn II: 3h
Cồn III; 12h
Mục đích: khử nước ra khỏi tổ chức.
Khử cồn: cho qua hệ thống gồm 3 lọ xylen
Xylen I: 3h
Xylen II: 3h
Xylen III: 12h
Mục đích: khử hết cồn ra khỏi rổ chức
Yêu cầu: khi nào miếng tổ chức trong như cục thạch là được, nếu để quá lâu tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và khó cắt.
Khử Xylen: Cho qua hệ thống paraffin đã ổn định, đặc chắc, đồng nhất, không lẫn tạp chất, không bọt, có từ 3 – 5% sáp ong đã nấu, gồm 3 lọ.
Paraffin I: 6h trong tủ ấm 56o
C Paraffin II: 6h trong tủ ấm 56oC Paraffin III: 12h trong tủ ấm 56oC
Mục đích: khử hết xylen trong tổ chức. Trong tổ chức chỉ còn paraffin thấm trong các kẽ mô bào. Nếu nhiệt độ trên 56oC tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và khó cắt.
Đúc block: Mục đích: đưa mẫu bệnh phẩm vào trong khối paraffin tạo thành một thể thống nhất.
Chuẩn bị: máy đúc block, paraffin.
Phương pháp tiến hành: đặt miếng bệnh phẩm nằm ngang vào chính giữa khuôn block, đổ nhanh paraffin lỏng vào khuôn block. Đặt khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy đúc khuôn block. Để nguội đến khi block đông cứng đặc chắc là được.
Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
Chuẩn bị: máy cắt, dao cắt, nước ấm 48 – 52oC, phiến kính, pank kẹp… Cắt mảnh: bằng máy cắt microtom, với độ dài 3 – 5 µm, sao cho mảnh cắt không rách, nát ở phần tổ chức.
Tãi mảnh: Dùng pank kẹp mảnh cắt đặt vào nước lạnh, dàn nhẹ sao cho mặt dưới của mảnh cắt ướt đều, lấy phiến kính hớt mảnh cắt cho sang nước ấm 48 - 52 oC rồi vớt mảnh cắt sao cho vị trí mảnh cắt ở 1/3 phiến kính. Sau đó để ở tủ ấm 37o
C trong vòng 24h.
Nhuộm tiêu bản: Các bước tiến hành:
Khử paraffin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ:
Xylen I: 30 phút
Xylen II; 30 phút Xylen III: 30 phút
Lưu ý: có thể để tiêu bản cần nhuộm vào xylen từ sáng, đến chiều nhuộm để tiêu bản sạch hết paraffin.
Khử xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 3 lọ: Cồn I: 7 phút
Cồn II: 7 phút
Cồn III: 7 phút
Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 10 phút.
Nhuộm Haematoxylin (nhuộm nhân)
Nhỏ haematoxylin ngập tiêu bản trong 5 phút, rửa nước, lau sạch quanh tiêu bản, kiểm tra màu sắc thấy tiêu bản xanh tím là được.
Sau đó cho tiêu bản rửa nước 5 phút loại bỏ hết haematoxylin thừa:
10 phút, rửa nước chảy cho hết eosin thừa.
Tẩy nước: Cho tiêu bản qua 3 lọ cồn 100o
mỗi lọ 1 phút.
Tẩy cồn làm trong tiêu bản:
Cho tiêu bản đi qua 3 lọ xylen, mỗi lọ 3 – 5 phút.
Gắn Baume canada: Nhỏ một giọt Baume Canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản.
Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi quang học vật kính 10. Nếu thấy màu xanh tím, bào tương bắt màu đỏ tươi, tiêu bản trong sáng. Không có nước, không có bọt khí.
3.4.2.4. Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu được được xử lý bằng phần mềm microsoft excel 2010 và phần mềm thống kê EpiTools Epidemiological Calculators (Ausvet, Australia). Sau khi thu thập số liệu, tổng kết sơ bộ được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học với các tham số và công thức sau.
- Số trung bình: X = n X n i i 1 - Độ lệch chuẩn: 2 1 1 n x x S n i i x
- Sai số của số trung bình:
mx =
X : số trung bình Trong đó:
xi: số hạng thứ i n: dung lượng mẫu.