ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Vi khuẩn được phân lập từ hồ công viên 29/3 Đà Nẵng
- Thuốc kháng sinh nghiên cứu là Ciprofloxacin, kháng sinh có nguồn gốc tổng hợp, thuộc nhóm Quinolon thế hệ II.
Hình 2.1. Thuốc Ciprofloxacin nghiên cứu
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và định danh một số lồi vi khuẩn nước hồ cơng viên 29/3.
- Xác định một số enzyme chính của vi khuẩn.
- Nghiên cứu tác động Ciprofloxacin ở các nồng độ khác nhau lên mức độ sống của các loài vi khuẩn này.
- Nghiên cứu sự thay đổi về hoạt tính enzyme của các lồi vi khuẩn sau khi tiếp xúc lâu dài với các loại kháng sinh ở các nồng độ khác nhau.
- Nghiên cứu thay đổi về mức độ nhạy cảm kháng sinh hoặc sự xuất hiện kháng kháng sinh của các loài vi khuẩn phân lập được đối với loại kháng sinh này tại các nồng độ tiếp xúc khác nhau.
- Đánh giá mối quan hệ tiềm tàng giữa hiện tượng kháng kháng sinh với sự thay đổi hoạt tính enzyme của các loài vi khuẩn này.
2.3. Địa điểm nghiên cứu
- Ngoài thực địa
Thu thập mẫu nước tại hồ công viên 29/3, Thành Phố Đà Nẵng để phân lập các chủng vi khuẩn cần nghiên cứu.
- Trong phịng thí nghiệm
Đề tài được tiến hành ở các phịng thí nghiệm khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng: phịng thí nghiệm Sinh lý – Hóa sinh – Vi sinh; phịng thí nghiệm Cơng Nghệ Sinh học; phịng thí nghiệm Phân tích Mơi trường. Phịng thí nghiệm tại Khoa Vi sinh của bệnh viện Đa khoa, Đà Nẵng.
2.4. Thiết kế thí nghiệm và phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Thiết kế thí nghiệm
Mục đích chủ yếu của thí nghiệm là xác định ảnh hưởng của thuốc Ciprofloxacin (nhóm fluoroquinolone) đến vi khuẩn nước trong nghiên cứu thí nghiệm.
Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của Ciprofloxacin với nồng độ khác nhau lên mức độ sống, hoạt tính enzyme của vi khuẩn và mức độ nhạy cảm với kháng sinh.
Thí nghiệm 1 : Vi khuẩn được nuôi trong các lọ chứa môi trường NB lỏng có
nồng độ thuốc ở các nồng độ thử nghiệm cuối cùng là tương đương với nồng độ loại kháng sinh đó được tìm thấy trong mơi trường nước mặt, và cao hơn nồng độ đó từ 10 – 100 lần để mơ phỏng nồng độ trong nước thải hoặc trong hoàn cảnh sử dụng kháng sinh với số lượng lớn hơn nhiều và không được kiểm soát chặt chẽ như các nước phát triển.(đối với mẫu đối chứng thay dung dịch thuốc bằng nước cất), lắc đều trên máy lắc (200 vòng/phút) cứ sau 24h mẫu vi khuẩn ở mỗi lọ được lấy ra để xác định mức độ sống, hoạt độ enzyme và cứ sau 48h vi khuẩn được cấy chuyền qua 2 đợt nữa trong môi trường giống môi trường ban đầu để tiến hành xác định mức độ sống, hoạt độ enzyme theo thời gian.
Bảng 2.1. Nồng độ thuốc thử nghiệm
STT Loại thuốc Các nồng độ thử nghiệm cuối cùng
Thí nghiệm 2: Xác định mức độ sống của vi khuẩn khi nuôi trong mơi trường có
kháng sinh.
Pha lỗng dung dịch vi khuẩn sau khi ni lắc theo phương pháp pha lỗng 10 lần [1] để được mật độ phù hợp. Sau đó trải đều dung dịch vi khuẩn khuẩn có thuốc kháng sinh nuôi cấy trên đĩa petri và lật đĩa lại, ủ ở 28-30 độ C trong 24 giờ.Kết quả được tính là số khuẩn lạc phát triển của vi khuẩn sống sót. So sánh với mẫu đối chứng.
Thí nghiệm 3: Xác định sự thay đổi hoạt độ enzyme của vi khuẩn khi ni trong
mơi trường có kháng sinh.
Sử dụng phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch [1]. Thạch sau khi được đục lỗ sẽ lần lượt nhỏ 0,1ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong kháng sinh sau 24h vào. Sau đó, để vào tủ ấm ở 28 – 30 độ C trong 48h. Đọc kết quả và so sánh đường kính phân giải so với lúc chưa thử thuốc.
2.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu và phân tích 2.4.2.1. Phƣơng pháp thu thập tài liệu
Tài liệu có liên quan đến nội dung nghiên cứu được thu thập từ các nguồn như sách, tạp chí, báo khoa học và trên mạng internet. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.4.2.2. Phƣơng pháp thu mẫu
Các mẫu nước được lấy theo TCVN 5994 -1995 (ISO 5667/4: 1987) [5]
Chọn 05 vị trí thu mẫu khác nhau tại hồ sau đó trộn 5 mẫu lại để được 1 mẫu đặc trưng. Mẫu được bảo quản lạnh, không được để ánh sáng tiếp xúc trực tiếp với mẫu và vận chuyển nhanh về phịng thí nghiệm để phân tích.
2.4.2.3. Phƣơng pháp phân lập
Phân lập các mẫu dựa trên phương pháp phân lập của Egorow [1], [3].
Lấy 1ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm có chứa 9ml nước cất, lắc đều, ta có độ pha lỗng 10-1. Hút ra 1ml cho vào ống nghiệm có chứa chứa sẵn 9ml nước cất, lắc đều, ta có độ pha lỗng 10-2
. Tiếp tục pha loãng cho đến nồng độ cần thiết.
Dùng pipet tiệt trùng hút dịch pha loãng ở nồng độ từ 10-2 đến 10-6 khoảng 0,1ml nhỏ vào đĩa petri chứa môi trường phân lập đã vô trùng, dùng que gạt trang đều trên mặt thạch. Sau đó, bao gói cẩn thận và nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 30 – 350C. Sau 3 ngày nuôi cấy, chọn những chủng khuẩn lạc riêng lẽ, mọc mạnh, cấy sang ống thạch nghiêng chứa cùng môi trường phân lập cho đến khi thuần chủng.
2.4.2.4. Phƣơng pháp định danh vi sinh vật
Xác định các đặc điểm về hình thái, phản ứng sinh hóa, kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản: nhuộm Gram, tính di động, catalase, oxidase, khả năng sử dụng đường trong điều kiện hiếu khí và yếm khí (O/F), dựa theo phương pháp của Frerichs và Millar (1993), và Buller (2004). Đồng thời, sử dụng bộ kít API 20E (BioMerieux) để định danh đến loài vi khuẩn [12].
2.4.2.5. Phƣơng pháp giữ giống vi sinh vật
Theo phương pháp Egorow, để bảo quản chủng giống vi sinh vật cho những nghiên cứu tiếp theo chúng tôi tiến hành cấy lại định kì trên mơi trường thạch nghiêng có cùng môi trường để ở tủ ấm ở 350C – 390C trong 2 -3 ngày. Sau đó bảo quản trong tủ lạnh ở 40
C, cấy chuyền định kì để giữ giống.
2.4.2.6. Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật
Vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa thích hợp đối với mỗi loại vi khuẩn.
( )
( )
2.4.2.7. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh hoạt tính enzim proteaza, xenlulaza và amylaza của vi sinh vật
Để xác định khả năng sinh hoạt tính enzym proteaza, xenlulaza và amylaza của vi sinh vật, chúng tôi dùng phương pháp đục lỗ thạch [1]. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: khi enzym proteaza, xenlulaza và amylaza thủy phân casein, CMC và tinh bột có trong mơi trường thạch sẽ tạo vịng phân giải màu trong suốt quanh lỗ thạch. Dựa vào số hiệu đường kính vào phân hủy và đường kính lỗ thạch mà ta xác định khả năng sinh hoạt tính enzym proteaza, xenlulaza và amylaza của vi sinh vật.
2.4.2.8. Phƣơng pháp xác định thời gian sinh trƣởng của vi khuẩn
Để xác định thời gian sinh trưởng của vi sinh vật tuyển chọn, chúng tôi tiến hành xây dựng đường cong sinh trưởng theo phương pháp nuôi cấy tĩnh [2].
2.4.2.9. Phƣơng pháp kháng sinh đồ
Phương pháp lập kháng sinh đồ được thực hiện theo tiêu chuẩn: The Clinical và Laboratory Standards Institute (CLSI) của Anonymous (2006), sử dụng môitrường
Mueller-Hinton Agar (MHA, Merck, Darmstadt, Germany) với khoanh giấy kháng sinh
Ciprofloxacin (5µg) (Bio-rad, Marnes-la-Coquettle, France) [13]
Chuẩn bị mẫu vi khuẩn cần đặt kháng sinh đồ. Nhặt 3-5 khuẩn lạc thuần trên đĩa sau đó hồ đều trong 3 - 5 ml nước muối sinh lý. Lắc đều bằng tay và so sánh tương đương với độ đục chuẩn Mc Farland 0,5, điều chỉnh độ đục bằng cách thêm nước muối sinh lý hoặc vi khuẩn. Trong vòng 15 phút sau khi điều chỉnh độ đục, dùng que tăm bông vơ trùng nhúng vào canh khuẩn, xoay trịn tăm bông vài lần rồi vắt bớt nước bằng cách ép tăm bông vào thành ống. Dùng tăm bơng vạch ngang 2 lần vng góc trên mặt đĩa thạch. Sau đó ria tăm bơng đều lên mặt thạch bằng cách mỗi lần ria xoay đĩa 60°. Dùng kẹp kim loại đặt nhẹ khoanh giấy cho tiếp xúc đều trên mặt thạch. Khoảng cách giữa các khoanh giấy là 24 mm, cách rìa đĩa thạch 15 mm. Ủ 24 – 48 giờ ở 28 – 300C, sinh khối khoảng 108 CFU/ml.
Đo đường kính vơ trùng (mm) theo tiêu chuẩn của Clinical và Laboratory (CLSI) (2006), nhằm xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình và kháng.
2.4.2.10. Phƣơng pháp xử lí số liệu
Phân tích sự khác biệt đối với các thơng số nghiên cứu giữa các nồng độ tiếp xúc với kháng sinh và mẫu đối chứng bằng phép thử 2-tailed t-test với phần mềm thống kê SPSS phiên bản 22 (với α=0,05).
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});