3.1 .Kết quả nghiên cứu
b. Kết quả hoạt độ Protease của các chủng vi khuẩn
Hình 3.10. Biểu đồ thể hiện sự thay đổi vịng phân giải Protease của E.Coli và
Pseudomonas sp. sau khi ni cấy trong mơi trường có thuốc kháng sinh Ciprofloxacin (Số liệu biểu diễn trị số trung bình của 3 mẫu với giá trị SE).
Kết quả phân tích cho thấy, hoạt tính protease của E.Coli và Pseudomonas sp. sau khi tiếp xúc với Ciprofloxacin nồng độ thấp có sự thay đổi so với mẫu đối chứng, sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (α=0,05). Cụ thể, đối với E.Coli, hoạt tính enzyme protease ở đợt 1 và đợt 2 đều giảm so với đối chứng. Đợt 1, giá trị trung bình ở các nồng độ so với đối chứng 35±1,15 (mm) lần lượt là 32,33± 0,8 (mm), 31,67 ± 0,6 (mm), 26,67 ± 0,8 và 30,33 ± 0,5 (mm). Đợt 2, giá trị trung bình của hoạt tính protease ở các nồng độ so với mẫu đối chứng ( 21 ± 0,57 mm) lần lượt là; 20,33 ± 0,33 mm; 17,33 ± 0,6 mm; 18,67 ± 0,33 mm và 16 ± 0,57 mm. Đối với đợt 3, giá trị trung bình của hoạt tính protease so với đối chứng ( 15 ± 0,57 mm) giảm ở các nồng độ 0,03 µg/L; 3 µg/L và 30 µg/L, nhưng lại khơng thay đổi ở nồng độ 0,3 µg/L (15,67 ± 0,88 mm).
Kết quả phân tích đối với Pseudomonas sp. , sau thời gian tiếp xúc lâu dài với thuốc thì khả năng sinh tổng hợp Protease của Pseudomonas sp. có sự thay đổi không đông nhất từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 6 sau 3 đợt ni cấy, sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p value ≤ α = 0,05). Ở đợt 1, so với mẫu đối chứng 24,67 ± 0,67 (mm), giá trị hoạt độ enzyme Protease có giảm cịn 17,33 ± 0,67 (mm) đối với nồng độ thuốc 0,03 µg/L, 21,33 ± 0,88 đối với nồng độ thuốc 0,3 µg/L , 17,66 ± 0,88 đối với nồng độ thuốc 30 µg/L, cịn ở nồng độ 3 µg/L giá trị hoạt độ enzyme tăng so với đối chứng là 29,67 ± 0,88 (mm). Đối với đợt 2, giá trị trung bình của hoạt tính protease theo nồng độ so với mẫu đối chứng 22,67 ± 0,88 (mm) giảm lần lượt là; 14,33 ± 0,88 (mm); 15,67 ± 0,67 (mm), 18,33 ± 0,67 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 0,03 0,3 3 30 Đƣ ờng k ính ( m m ) Nồng độ µg/L Escherichia coli Đợt 1 Đợt 2 Đợt 3 0 5 10 15 20 25 30 35 0 0,03 0,3 3 30 Đƣờ ng k ín h (m m ) Nồng độ µg/L Pseudomonas sp. Đợt 1 Đợt 2 Đợt 3
(mm) và 8,33 ± 0,67 (mm). Ở đợt 3, hoạt tính protease có sự thay đổi khá đáng kể so với đối chứng 15,33 ± 0,88 (mm), giá trị trung bình theo nồng độ lần lượt là 12 ± 0,57 (mm); 9,33 ± 0,88 (mm); 8,67 ± 0,88 (mm) và 6± 0,58 (mm).
Bảng 3.7. Bảng trị số pvalue ở các nồng độ so với đối chứng của Ciprofloxacin đối với
hoạt độ enzyme protease
3.1.5. Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn
Kết quả đường kính vịng vơ khuẩn (mm) của Escherichia coli và Pseudomonas
sp. được trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3.8. Đường kính vịng vơ khuẩn của Escherichia coli và Pseudomonas sp. với thuốc
kháng sinh Ciprofloxacin (trung bình ± SE) (n=3)
Chủng vi khuẩn Thời gian (giờ) Nồng độ 0,03 µg/L so với đối chứng Nồng độ 0,3 µg/L so với đối chứng Nồng độ 3 µg/L so với đối chứng Nồng độ 30 µg/L so với đối chứng Escherichia coli
Đợt 1 Pvalue = 0,020 Pvalue = 0,050 Pvalue = 0,010 Pvalue =0,010 Đợt 2 Pvalue = 0,008 Pvalue = 0,050 Pvalue = 0,030 Pvalue = 0,007 Đợt 3 Pvalue = 0,010 Pvalue = 0,010 Pvalue = 0,050 Pvalue = 0,050
Pseudomonas
sp.
Đợt 1 Pvalue = 0,008 Pvalue= 0,010 Pvalue = 0,013 Pvalue =0,007 Đợt 2 Pvalue = 0,050 Pvalue = 0,026 Pvalue = 0,060 Pvalue = 0,010 Đợt 3 Pvalue = 0,038 Pvalue = 0,035 Pvalue = 0,044 Pvalue = 0,001
Nồng độ
Chủng vi khuẩn
0 0,03 0,3 3 30
Escherichia coli 29,67 ±0,5 22,67 ±0,5 19,5 ±0,5 17,33 ±0,5 16,33 ±0,5
Hình 3.11. Biểu đồ thể hiện độ nhạy của các chủng vi khuẩn ở các nồng độ thuốc
kháng sinh khác nhau sau khi tiếp xúc lâu dài với Ciprofloxacin
Ghi chú: Mức kháng kháng sinh theo tiêu chuẩn của CLSI (Ciproploxacin: 5µg, đường kính trung gian 16 – 20 mm)
0 5 10 15 20 25 30 35 0 0,03 0,3 3 30 Đườ ng kín h (m m) KHÁNG SINH ĐỒ Escherichia coli Pseudomonas sp. Hình 3.12. Kết quả thử kháng sinh đồ theo nồng độ 0; 0,03; 0,3; 3 và 30 µg/L lần lượt từ trái qua phải của Escherichia
coli
Hình 3.13. Kết quả thử kháng sinh đồ 0;
0,03; 0,3; 3 và 30 µg/L lần lượt từ trái qua phải của Pseudomonas sp.
Dựa theo tiêu chuẩn của CLSI [13], kết quả đo đường kính vịng vơ khuẩn của
Escherichia coli và Pseudomonas sp. khi nuôi cấy trong mơi trường khơng có kháng sinh
đều nhạy cảm với Ciprofloxacin.
Kết quả thực hiện kháng sinh đồ của Escherichia coli và Pseudomonas sp. sau khi được nuôi trong kháng sinh ở các nồng độ khác nhau cho thấy độ nhạy đối với Ciprofloxacin của E.coli và Pseudomonas sp. đều giảm dần từ 29,67 ± 0,5 xuống 16,33 ± 0,5 đối với E.coli và từ 29,67 ± 0,5 xuống 9,5 ± 0,5 đối với Pseudomonas sp.. Đặc biệt là
Pseudomonas sp., ở các nồng độ 0,3; 3; 30 µg/L đường kính vịng vơ khuẩn giảm tới mức
kháng kháng sinh ( < 16mm) so với tiêu chuẩn CLSI.
Kết quả sau khi nuôi cấy Escherichia coli và Pseudomonas sp. trong môi trường có kháng sinh đã làm giảm đường kính vịng vơ khuẩn. Từ kết quả trên cho thấy, với nồng độ kháng sinh thử nghiệm tương ứng với nồng độ kháng sinh có mặt trong nước đã làm thay đổi độ nhạy của vi khuẩn đối với thuốc. Tương ứng với độ nhạy giảm dần của vi khuẩn, sự thay đổi này tuy không lớn nhưng nếu như cứ tác động liên tục sẽ dẫn đến việc xuất hiện các vi khuẩn kháng kháng sinh trong môi trường tự nhiên.
3.2. Biện luận
3.2.1. Ảnh hƣởng của kháng sinh lên mức độ sống của vi khuẩn
Escherichia coli và Pseudomonas sp. là các vi khuẩn gram âm có thể được tìm
thấy trong một phạm vi rộng các mơi trường, đặc biệt là môi trường nước [42]. Đây là các vi khuẩn có nguồn gốc gây bệnh cho người. Trước đây, Escherichia coli và
Pseudomonas sp. là những vi khuẩn được cho là sống sót kém trong mơi trường và không phát triển, chúng chỉ sống trong nước một thời gian nhất định. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng Escherichia coli và Pseudomonas sp. có thể tồn tại trong một thời gian dài trong mơi trường và có khả năng phát triển trong mơi trường nước, trong đất [43]. Khả năng các vi khuẩn này có thể tồn tại trong mơi trường có thể là do sự ổn định của chúng trong việc thu nhận các năng lượng và do cấu tạo đơn giản của chúng nên dễ dàng trong việc thích nghi với mơi trường.[42]
Qua 3 đợt nuôi cấy Escherichia coli và Pseudomonas sp. trong môi trường với các nồng độ kháng sinh khác nhau, mô phỏng sự tiếp xúc thường xuyên qua nhiều thế hệ vi sinh vật với thuốc kháng sinh Ciprofloxacin có mặt trong mơi trường tự nhiên thì số lượng CFU/ml của cả hai chủng vi khuẩn đều có sự thay đổi ở các mức nồng độ tiếp xúc khác nhau. Bên cạnh đó, hình thái của các chủng vi khuẩn quan sát được qua 3 đợt nuôi cấy khi có kháng sinh so với đối chứng cũng có sự thay đổi về màu sắc, kích thước khuẩn lạc. Điều này cho thấy, Ciprofloxacin đã ảnh hưởng đến mức độ sống của các chủng vi khuẩn dù chỉ với nồng độ rất thấp, có thể các chủng vi khuẩn này đã tự tạo ra một cơ chế nào đó để thích nghi với kích thích của mơi trường trong thời gian dài. Ban đầu, kháng sinh có thể tiêu diệt hoặc ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn [19]. Nhưng do biến đổi bên trong cùng một loài vi khuẩn, một hoặc hai trong số chúng có thể sống sót bởi vì khả năng trung hịa tác dụng của kháng sinh. Sau đó các vi khuẩn kháng cịn sót lại có thể nhân lên và thay thế tất cả các vi khuẩn bị giết chết, làm cho quần thể E.Coli và Pseudomonas sp. trong nước có thể tăng lên, dẫn đến việc khơng có sinh vật đối kháng và cạnh tranh với chúng. Điều này cho thấy rằng trong những trường hợp như vậy có ảnh hưởng đến sự tồn tại của hệ vi sinh vật tự nhiên ( Jiang và cộng sự, 2002 ; Unc và cộng sự, 2006 ; Semenov và cộng sự, 2007 ). Khi so sánh với kết quả của Jan Dirk van Elsas [43] về sự sinh trưởng của E.Coli trong mơi trường có kháng sinh trong tự nhiên, thì thấy tương tự.
Điều này làm ảnh hưởng của sự đa dạng và cấu trúc cộng đồng của vi sinh vật bản xứ đối với số lượng quần thể E. Coli và Pseudomonas sp. xâm chiếm trong môi trường. Một nghiên cứu được tiến hành tại Lakes Dom Helvécio, Gambazinho và
Jacaré ở Rio Doce / MG so sánh các mẫu từ hai giai đoạn khác nhau (năm 2003 và 2005) trong cùng môi trường đã phát hiện tỷ lệ 97% vi khuẩn Gram âm và chỉ có 3% Vi khuẩn Gram dương có trong hồ, cho thấy hiện tượng kháng thuốc đã tăng lên trong những môi trường này (Pontes và cộng sự, 2009) [49].
Tiếp theo đó, sự thay đổi của cấu trúc lồi ảnh hưởng đến chức năng sinh thái như: sản xuất sinh khối và chuyển đổi chất dinh dưỡng, gia tăng sự đề kháng và gây xáo trộn chức năng trong hệ sinh thái vi mô, bao gồm cả việc chuyển đổi nitơ, methanogenesis và sulfat [14], gây nên sự kháng thuốc, cũng như các sản phẩm chuyển hóa của chúng có thể là những hợp chất có độc tính cao.
3.2.2. Ảnh hƣởng của kháng sinh lên hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn dƣới góc độ sinh thái học
Các vi khuẩn thủy sinh như Escherichia coli và Pseudomonas sp. tuy có nguồn gốc từ con người, nhưng được khẳng định đóng vai trị rất quan trọng cho môi trường nước, chúng tham gia vào quá trình phân hủy các chất hữu cơ, chu kỳ dinh dưỡng và năng lượng dòng chảy (Bernhard và cộng sự, 2005) [44]. Do đó, khả năng sinh tổng hợp enzyme Cellulase, Protease… của E.Coli cũng rất quan trọng đối với đời sống
thủy sinh. Enzyme có vai trị quan trọng đối với cơ thể sống của sinh vật cũng như đối với môi trường sinh thái, nó giúp cho các phản ứng sinh hóa trong tế bào diễn ra nhanh hơn tạo điều kiện cho các hoạt động sống của tế bào. Đặc biệt tế bào có thể tự điều chỉnh q trình chuyển hóa vật chất để thích nghi với mơi trường bằng cách điều chỉnh hoạt tính của các enzyme. Một số nghiên cứu cho thấy enzyme tham gia vào việc phân hủy các chất ô nhiễm hữu cơ độc hại [44]. Enzyme là chất xúc tác sinh học tạo thuận lợi cho việc biến đổi chất nền thành sản phẩm bằng cách tạo ra các điều kiện thuận lợi làm giảm năng lượng kích hoạt của phản ứng. Các enzyme cellulase có khả năng phân huỷ Cellulase tinh thể thành glucose. Protease thuộc nhóm các enzyme thủy phân liên kết peptit trong mơi trường nước và tổng hợp chúng trong môi trường khơng nắng, nó có vai trị quan trọng trong sinh lý học vi sinh vật.Các enzyme phân hủy protein có tính cơ học, cấu trúc và chức năng rất đa dạng. Sự đa dạng về chức năng của Protease đi kèm với một loạt sự đa dạng về cấu trúc có thể được phân nhóm rộng rãi dựa trên việc chúng được tìm thấy bên trong hay bên ngoài tế bào [45]. Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, ở động vật có vú, Protease có liên quan đến lâm sàng và là mục tiêu cho khoảng 5-10 % của tất cả các loại thuốc đang phát triển [45].
Qua 3 đợt nuôi cấy E.Coli và Pseudomonas sp. trong môi trường với các nồng độ kháng sinh khác nhau, mô phỏng sự tiếp xúc thường xuyên qua nhiều thế hệ vi sinh
vật với Ciprofloxacin có mặt trong mơi trường tự nhiên, thì hoạt tính Protease và Cellulase của E.Coli có sự thay đổi theo chiều hướng giảm dần so với mẫu đối chứng. Điều này cho thấy các loại thuốc kháng sinh đã ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn dù chỉ với ở nồng độ rất thấp trong môi trường, kết quả nghiên cứu là tương đồng với kết quả của Lucía Fernández [46]. Cũng cho thấy rằng, nếu sự tiếp nhận liên tục của các loại thuốc kháng sinh vào mơi trường thì sẽ có nguy cơ gây ra những ức chế đối với khả năng sinh tổng hợp enzyme của E.Coli, Pseudomonas sp., ảnh hưởng đến khả năng phân giải các chất hữu cơ trong mơi trường và hình thành nên màng sinh học (biofilm). Giống như sự di chuyển, các màng sinh học đại diện cho hoạt động của một tổ hợp vi khuẩn trong môi trường nước mặt. Nghiên cứu của Lucía Fernández (2012) đã cho thấy sự khác biệt (giảm đi) về hình thành màng sinh học, tương ứng là khoảng 65%, 70% và 35% so với mức tự nhiên sau khi thử nghiệm với thuốc piperacillin, ceftaidime, ciprofloxacin [46] của Pseudomonas aeruginos. Nghiên cứu này đã củng cố quan niệm cho rằng tính độc hại và tính nhạy cảm với kháng sinh của vi khuẩn có liên quan đến sự tổng hợp protein. Việc hình thành màng sinh học là một nhân tố quan trọng về mặt sinh thái. Nó điều khiển các chu trình Sinh - Địa – Hóa của hầu hết các yếu tố/ thành phần trong môi trường nước, dự trữ nguồn tài nguyên và có vai trị trong việc tăng khả năng sống sót khi tiếp xúc với kháng sinh hoặc thuốc chống vi khuẩn [46]. Ngược lại, các vi sinh vật trong màng sinh học có tính kháng các chất kháng sinh cao hơn 1000 lần so với ở trạng thái tự do, gây ra ảnh hưởng đến các sinh vật trong nước khác và môi trường sinh thái cũng như con người. Do đó, màng sinh học vừa hoạt động như một bồn rửa, nhưng cũng là một nguồn gây ô nhiễm.
3.2.3. Ảnh hƣởng của việc tiếp xúc lâu dài với kháng sinh ở nồng độ thấp đến mức độ nhạy cảm của các chủng vi khuẩn nƣớc mặt
Các dữ liệu được trình bày cho thấy ngay cả trong những mơi trường có nồng độ kháng sinh rất thấp, việc vi khuẩn kháng kháng sinh vẫn có thể xảy ra và có khả năng phát tán gen kháng kháng sinh cho các loài vi sinh vật khác. Nồng độ kháng sinh trong môi trường tự nhiên có thể thay đổi tùy thuộc vào môi trường cụ thể. Ví dụ, nồng độ cho Ciprofloxacin trong các thí nghiệm của tôi tương ứng với 0,36 µg /l, tương tự như nồng độ có thể tìm thấy trong một số môi trường nước hồ [48].
Việc xuất hiện vi khuẩn kháng kháng sinh trong môi trường thủy sinh đã tăng lên đáng kể (Miyake và cộng sự, 2003).Trong 25 năm gần đây ở Braxin, các vi khuẩn kháng đã được xác định ở vùng nước sông (De Mondino và cộng sự, 1995. Souza và cộng sự, 2000, Falcão và cộng sự, 2004), hồ và ao; (De Mondino và cộng sự, 1995,
Falcão và cộng sự, 2004, Pontes và cộng sự, 2009, Salloto và cộng sự, 2012) và trên biển (De Mondino và cộng sự, 1995. Falcão và cộng sự, 2004; Cardonha và cộng sự, 2004, De Oliveira và Pinhata, 2008, De Oliveira và cộng sự, 2010). Trong một nghiên cứu về nước hồ và sông, được tiến hành tại Araraquara, bang São Paulo, tỷ lệ hiện nhiễm 50% đa kháng ở các chủng vi khuẩn đã được tìm thấy [49].
Từ kết quả phân tích được, sự nhạy cảm với kháng sinh của E.Coli và Pseudomonas sp. giảm dần ở các nồng độ kháng sinh khác nhau cho thấy, nồng độ kháng sinh rất thấp trong môi trường cũng có thể dẫn đến việc tồn tại các vi khuẩn kháng thuốc hiện có trong quần thể. Điều này đặc biệt quan trọng đối với các mầm bệnh do vi khuẩn có chu kỳ sống bình thường liên quan đến sự phát triển của môi trường định kỳ trong môi trường nước (E.Coli). Việc tiếp xúc lâu dài với kháng sinh làm cho độ nhạy giảm và mức kháng kháng sinh có thể tăng lên trong số các dịng vi khuẩn phân lập từ mơi trường có thể là dấu hiệu của việc sử dụng quá mức hoặc lạm dụng thuốc chống vi khuẩn trong những môi trường này. Nghiên cứu của Erik Gullberg [58] cũng cho thấy rằng ở nồng độ 1/30 của MIC susc của Salmonella typhimurium với Ciprofloxacin thì độ nhạy giảm 15% so với khi khơng có kháng sinh.
Như vậy, khi so sánh với kết quả này với kết quả nghiên cứu được thì thấy tương tự. Việc sử dụng kháng sinh của con người có thể dẫn đến việc xuất hiện các vi khuẩn mang gen kháng kháng sinh. Các vi khuẩn này khi xâm nhập vào mơi trường sẽ có nguy cơ truyền các gen kháng kháng sinh cho các quần thể sinh vật khác trong hệ sinh thái [50]. Các yếu tố di truyền có khả năng trao đổi gen kháng kháng sinh đã được phát hiện trong một số mẫu nước chỉ ra rằng việc kháng kháng sinh ở vi khuẩn có thể