- Ngoài thực địa
Thu thập mẫu nước tại hồ công viên 29/3, Thành Phố Đà Nẵng để phân lập các chủng vi khuẩn cần nghiên cứu.
- Trong phòng thí nghiệm
Đề tài được tiến hành ở các phòng thí nghiệm khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng: phòng thí nghiệm Sinh lý – Hóa sinh – Vi sinh; phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh học; phòng thí nghiệm Phân tích Môi trường. Phòng thí nghiệm tại Khoa Vi sinh của bệnh viện Đa khoa, Đà Nẵng.
2.4. Thiết kế thí nghiệm và phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Thiết kế thí nghiệm
Mục đích chủ yếu của thí nghiệm là xác định ảnh hưởng của thuốc Ciprofloxacin (nhóm fluoroquinolone) đến vi khuẩn nước trong nghiên cứu thí nghiệm.
Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của Ciprofloxacin với nồng độ khác nhau lên mức độ sống, hoạt tính enzyme của vi khuẩn và mức độ nhạy cảm với kháng sinh.
Thí nghiệm 1 : Vi khuẩn được nuôi trong các lọ chứa môi trường NB lỏng có
nồng độ thuốc ở các nồng độ thử nghiệm cuối cùng là tương đương với nồng độ loại kháng sinh đó được tìm thấy trong môi trường nước mặt, và cao hơn nồng độ đó từ 10 – 100 lần để mô phỏng nồng độ trong nước thải hoặc trong hoàn cảnh sử dụng kháng sinh với số lượng lớn hơn nhiều và không được kiểm soát chặt chẽ như các nước phát triển.(đối với mẫu đối chứng thay dung dịch thuốc bằng nước cất), lắc đều trên máy lắc (200 vòng/phút) cứ sau 24h mẫu vi khuẩn ở mỗi lọ được lấy ra để xác định mức độ sống, hoạt độ enzyme và cứ sau 48h vi khuẩn được cấy chuyền qua 2 đợt nữa trong môi trường giống môi trường ban đầu để tiến hành xác định mức độ sống, hoạt độ enzyme theo thời gian.
Bảng 2.1. Nồng độ thuốc thử nghiệm
STT Loại thuốc Các nồng độ thử nghiệm cuối cùng
Thí nghiệm 2: Xác định mức độ sống của vi khuẩn khi nuôi trong môi trường có
kháng sinh.
Pha loãng dung dịch vi khuẩn sau khi nuôi lắc theo phương pháp pha loãng 10 lần [1] để được mật độ phù hợp. Sau đó trải đều dung dịch vi khuẩn khuẩn có thuốc kháng sinh nuôi cấy trên đĩa petri và lật đĩa lại, ủ ở 28-30 độ C trong 24 giờ.Kết quả được tính là số khuẩn lạc phát triển của vi khuẩn sống sót. So sánh với mẫu đối chứng.
Thí nghiệm 3: Xác định sự thay đổi hoạt độ enzyme của vi khuẩn khi nuôi trong
môi trường có kháng sinh.
Sử dụng phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch [1]. Thạch sau khi được đục lỗ sẽ lần lượt nhỏ 0,1ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong kháng sinh sau 24h vào. Sau đó, để vào tủ ấm ở 28 – 30 độ C trong 48h. Đọc kết quả và so sánh đường kính phân giải so với lúc chưa thử thuốc.
2.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu và phân tích 2.4.2.1. Phƣơng pháp thu thập tài liệu
Tài liệu có liên quan đến nội dung nghiên cứu được thu thập từ các nguồn như sách, tạp chí, báo khoa học và trên mạng internet.
2.4.2.2. Phƣơng pháp thu mẫu
Các mẫu nước được lấy theo TCVN 5994 -1995 (ISO 5667/4: 1987) [5]
Chọn 05 vị trí thu mẫu khác nhau tại hồ sau đó trộn 5 mẫu lại để được 1 mẫu đặc trưng. Mẫu được bảo quản lạnh, không được để ánh sáng tiếp xúc trực tiếp với mẫu và vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm để phân tích.
2.4.2.3. Phƣơng pháp phân lập
Phân lập các mẫu dựa trên phương pháp phân lập của Egorow [1], [3].
Lấy 1ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm có chứa 9ml nước cất, lắc đều, ta có độ pha loãng 10-1. Hút ra 1ml cho vào ống nghiệm có chứa chứa sẵn 9ml nước cất, lắc đều, ta có độ pha loãng 10-2
. Tiếp tục pha loãng cho đến nồng độ cần thiết.
Dùng pipet tiệt trùng hút dịch pha loãng ở nồng độ từ 10-2 đến 10-6 khoảng 0,1ml nhỏ vào đĩa petri chứa môi trường phân lập đã vô trùng, dùng que gạt trang đều trên mặt thạch. Sau đó, bao gói cẩn thận và nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 30 – 350C. Sau 3 ngày nuôi cấy, chọn những chủng khuẩn lạc riêng lẽ, mọc mạnh, cấy sang ống thạch nghiêng chứa cùng môi trường phân lập cho đến khi thuần chủng.
2.4.2.4. Phƣơng pháp định danh vi sinh vật
Xác định các đặc điểm về hình thái, phản ứng sinh hóa, kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản: nhuộm Gram, tính di động, catalase, oxidase, khả năng sử dụng đường trong điều kiện hiếu khí và yếm khí (O/F), dựa theo phương pháp của Frerichs và Millar (1993), và Buller (2004). Đồng thời, sử dụng bộ kít API 20E (BioMerieux) để định danh đến loài vi khuẩn [12].
2.4.2.5. Phƣơng pháp giữ giống vi sinh vật
Theo phương pháp Egorow, để bảo quản chủng giống vi sinh vật cho những nghiên cứu tiếp theo chúng tôi tiến hành cấy lại định kì trên môi trường thạch nghiêng có cùng môi trường để ở tủ ấm ở 350C – 390C trong 2 -3 ngày. Sau đó bảo quản trong tủ lạnh ở 40 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C, cấy chuyền định kì để giữ giống.
2.4.2.6. Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật
Vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa thích hợp đối với mỗi loại vi khuẩn.
( )
( )
2.4.2.7. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh hoạt tính enzim proteaza, xenlulaza và amylaza của vi sinh vật
Để xác định khả năng sinh hoạt tính enzym proteaza, xenlulaza và amylaza của vi sinh vật, chúng tôi dùng phương pháp đục lỗ thạch [1]. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: khi enzym proteaza, xenlulaza và amylaza thủy phân casein, CMC và tinh bột có trong môi trường thạch sẽ tạo vòng phân giải màu trong suốt quanh lỗ thạch. Dựa vào số hiệu đường kính vào phân hủy và đường kính lỗ thạch mà ta xác định khả năng sinh hoạt tính enzym proteaza, xenlulaza và amylaza của vi sinh vật.
2.4.2.8. Phƣơng pháp xác định thời gian sinh trƣởng của vi khuẩn
Để xác định thời gian sinh trưởng của vi sinh vật tuyển chọn, chúng tôi tiến hành xây dựng đường cong sinh trưởng theo phương pháp nuôi cấy tĩnh [2].
2.4.2.9. Phƣơng pháp kháng sinh đồ
Phương pháp lập kháng sinh đồ được thực hiện theo tiêu chuẩn: The Clinical và Laboratory Standards Institute (CLSI) của Anonymous (2006), sử dụng môitrường
Mueller-Hinton Agar (MHA, Merck, Darmstadt, Germany) với khoanh giấy kháng sinh
Ciprofloxacin (5µg) (Bio-rad, Marnes-la-Coquettle, France) [13]
Chuẩn bị mẫu vi khuẩn cần đặt kháng sinh đồ. Nhặt 3-5 khuẩn lạc thuần trên đĩa sau đó hoà đều trong 3 - 5 ml nước muối sinh lý. Lắc đều bằng tay và so sánh tương đương với độ đục chuẩn Mc Farland 0,5, điều chỉnh độ đục bằng cách thêm nước muối sinh lý hoặc vi khuẩn. Trong vòng 15 phút sau khi điều chỉnh độ đục, dùng que tăm bông vô trùng nhúng vào canh khuẩn, xoay tròn tăm bông vài lần rồi vắt bớt nước bằng cách ép tăm bông vào thành ống. Dùng tăm bông vạch ngang 2 lần vuông góc trên mặt đĩa thạch. Sau đó ria tăm bông đều lên mặt thạch bằng cách mỗi lần ria xoay đĩa 60°. Dùng kẹp kim loại đặt nhẹ khoanh giấy cho tiếp xúc đều trên mặt thạch. Khoảng cách giữa các khoanh giấy là 24 mm, cách rìa đĩa thạch 15 mm. Ủ 24 – 48 giờ ở 28 – 300C, sinh khối khoảng 108 CFU/ml.
Đo đường kính vô trùng (mm) theo tiêu chuẩn của Clinical và Laboratory (CLSI) (2006), nhằm xác định loại kháng sinh nhạy, trung bình và kháng.
2.4.2.10. Phƣơng pháp xử lí số liệu
Phân tích sự khác biệt đối với các thông số nghiên cứu giữa các nồng độ tiếp xúc với kháng sinh và mẫu đối chứng bằng phép thử 2-tailed t-test với phần mềm thống kê SPSS phiên bản 22 (với α=0,05).
Chƣơng 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu
3.1.1. Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn từ nƣớc mặt
Từ mẫu nước mặt thu ở hồ công viên 29/3 thành phố Đà Nẵng, tiến hành phân lập và định danh được 7 chủng vi khuẩn. Các chủng được phân lập có hình thái khuẩn lạc và hình thái soi kính hiển vi sau khi nhuộm gram như bảng 3.1.
Bảng 3.1. Hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập từ hồ công viên 29/3
Chủng
phân lập Hình thái khuẩn lạc Hình thái nhuộm gram
C1 Tròn, màu hồng đậm, hơi lõm, có tâm sâu. Trực khuẩn bắt màu Gram âm
C2 Tròn, trắng xám, trơn, bóng, lồi nhẹ Hình que, bắt màu Gram âm
C3 Tròn, khuẩn lạc lầy nhầy, màu xám, hơi phồng. Trực khuẩn bắt màu Gram âm C4 Tròn, bóng, màu hồng đậm, hơi phồng Trực khuẩn Gram âm
C5 Khuẩn lạc vàng lớn Hình que, Gram âm
C6 Khuẩn lạc tròn, nhầy, màu trắng có viền răng
cưa không đều Hình que, Gram dương (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
C7 Khuẩn lạc có dạng tròn trơn bóng,đục vun mờ Cầu khuẩn, bắt màu Gram dương
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn phân lập được
Hình 3.2. Kết quả nhuộm gram của một số chủng phân lập
C3 C6
C1 C2
C4 C3
Qua bảng 3.1 nhận thấy, các chủng vi khuẩn có sự đa dạng về hình thái khuẩn lạc, hình dạng và màu sắc phong phú như: tròn, trơn, bóng, màu hồng nhạt....Tuy nhiên, hình thái phổ biến nhất là tròn, bóng, không có viền.
Trên cơ sở đó, nhóm đã tiến hành các thử nghiệm sinh hóa cùng với sử dụng bộ test API và định danh được 7 chủng vi khuẩn được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả test sinh hoá định danh các chủng vi khuẩn
Chủng vi khuẩn C1 Escherichia coli C2 Pseudomonas sp. C3 Klebsiella pneumoniae C4 Burkholderia pseudomallei C5 Vibrio vulnificus C6 Bacillus subtilis C7 Staphylococcus epidermidis Gram - - - - - + + Urease - - + - - - - Glucose + - + - + - + Lactose + - + - + - + Sinh hơi + - - - - - - H2S - - - - - - - Citrate - + + + + - - Catalase - + + + + + + Oxidase - + + + + + - Di động + + - + + - -
Hình 3.4. Kết quả định danh sử dụng bộ test API của một số chủng vi khuẩn
Từ những kết quả phân lập và định danh trên, ta nhận thấy Pseudomonas sp. và
Escherichia coli là những chủng vi khuẩn có sự xuất hiện khuẩn lạc nhiều trong nước mặt và để thuận tiện trong nuôi cấy, giữ giống tôi chọn 2 chủng vi khuẩn trên cho bài nghiên cứu này.
3.1.2. Kết quả đo đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn
Tiến hành đo đường cong sinh trưởng của 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas sp. và
Escherichia coli đã phân lập và định danh, ta thu được kết quả trình bày ở bảng 3.3.
Escherichia coli
Burkholderia pseudomallei
Bảng 3.3. Kết quả đo đường cong sinh trưởng của các chủng vi sinh vật (Số liệu biểu diễn trị số trung bình của 3 mẫu với giá trị SE)
Chủng vi sinh vật Thời gian (giờ) Số lƣợng.108 CFU/ml ± SE
Escherichia coli 0 13,67 ± 1,2 12 62,67 ± 1,2 24 141,67 ± 4,4 36 160,33 ± 1,7 48 168,33 ± 1,7 60 110 ± 4,04 72 56 ± 1,2 Pseudomonas sp. 0 7,33 ± 1,4 12 32 ± 2,08 24 103,67 ± 3,48 36 120,33 ± 1,33 48 133,67 ± 4,7 60 46,67 ± 1,7 72 15,67 ± 1,7
Hình 3.5. Biểu đồ biểu thị đường cong sinh trưởng của các chủng vi sinh vật
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0h 12h 24h 36h 48h 60h 72h Số lƣợng .1 08 CF U/m l ĐƢỜNG CONG SINH TRƢỞNG Escherichia coli Pseudomonas sp.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, thời gian sinh trưởng tốt của Escherichia coli là từ 0 đến 48 giờ (tăng từ 13,67 ± 1,2 đến 168,33 ± 1,7 CFU/ml) và sau 48 giờ, số lượng CFU/ml bắt đầu giảm xuống còn 110 ± 4,04 ở 36 giờ và 56 ± 1,2 ở 72 giờ. Số lượng CFU/ml của Pseudomonas sp.tăng từ 7,33 ± 1,4 lên 133,67 ± 4,7 trong khoảng thời gian từ 0 đến 48 giờ. Sau đó, số lượng CFU/ml có dấu hiệu giảm dần. Điều này cho thấy, thời gian sinh trưởng của Escherichia coli và Pseudomonas sp. là 48 giờ.
3.1.3. Kết quả đánh giá tác động của Ciprofloxacin ở các nồng độ khác nhau lên mức độ sống của các chủng vi khuẩn khi nuôi trong môi trƣờng có kháng sinh mức độ sống của các chủng vi khuẩn khi nuôi trong môi trƣờng có kháng sinh qua 3 đợt cấy chuyền
Để xác định ảnh hưởng của Ciprofloxacinlên mức độ sống của Escherichia coli và
Pseudomonas sp. , tiến hành nuôi lắc trên môi trường LB với vận tốc lắc 220 vòng/phút. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Kết quả sinh trưởng của các chủng vi khuẩn khi nuôi trong môi trường có kháng sinh qua 3 đợt cấy chuyền (Số liệu biểu diễn trị số trung bình của 3 mẫu
với giá trị SE)
Chủng vi khuẩn Thời gian (giờ) Nồng độ (µg/L) Số lƣợng.108 CFU/ml ± SE Escherichia coli 0 0,03 0,3 3 30 48h đợt 1 171,67±4,4 176,33±5,2 185±2,8 117±5,2 142,67±5,01 48h đợt 2 185±4,1 198,33±4,4 206,67±3,3 105,33±8,6 96±6,02 48h đợt 3 142,33±9,5 169±4,2 163,67±7,3 100,33±11,4 44,33±11,4 Pseudomonas sp. 48h đợt 1 224,67±8,6 187,67±7,8 233,33±8,8 254,67±7,8 143,33±4,4 48h đợt 2 176,33±6,3 113,67±4,1 170±6,1 200±5,7 150±2,8 48h đợt 3 162,33±7,8 109,33±8,1 175,33±2,6 190±5,7 75±6,5 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.6. Biểu đồ biểu thị ảnh hưởng của Ciprofloxacin lên mức độ sống của các chủng vi khuẩn khi nuôi trong môi trường có kháng sinh qua 3 đợt cấy chuyền.
Kết quả ở bảng 3.4 và hình 3.6 cho thấy, khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn qua các nồng độ có sự khác nhau so với đối chứng. Sau thời gian tiếp xúc lâu dài với thuốc ở các nồng độ khác nhau thì số lượng CFU/ml của Escherichia coli có sự thay đổi không đồng nhất so với đối chứng. Ở đợt 1 sau 2 ngày tiếp xúc với thuốc, số lượng CFU/ml của E.Coli ở nồng độ 0,03 µg/L không thay đổi so với đối chứng (171,67±4,4), tăng ở nồng độ 0,3 µg/L lên 185±2,8; ở các nồng độ 3 và 30 µg/L số lượng CFU/ml có giảm so với đối chứng. Sau 4 ngày tiếp xúc với thuốc ở đợt 2, số lượng CFU/ml của
E.Coli cũng tăng ở các nồng độ 0,03; 0,3 µg/L và giảm ở nồng độ 3;30 µg/L so với đối chứng 185±4,1. Sau 6 ngày nuôi cấy trong thuốc ở đợt 3, số lượng CFU/ml cũng như hai đợt trước và sự khác biệt giữa các nồng độ với mẫu đối chứng càng rõ rệt. Đối với
Pseudomonas sp. , ở đợt 1, số lượng CFU/ml giảm ở nồng độ 0,03 µg/L so với đối chứng 224,67±8,6; ở nồng độ 0,3 và 3 µg/L thì số lượng CFU/ml tăng so với đối chứng và ở nồng độ 30 µg/L thì có dấu hiệu giảm mạnh so với đối chứng. Đối với đợt 2, số lượng CFU/ml giảm so với đối chứng (176,33±6,3) là 113,67±4,1; 170±6,1; 200±5,7 và 150±2,8. Đối với đợt 3, sự tăng giảm số lượng CFU/ml của Pseudomonas sp. theo nồng độ tương tự như đợt 1 và đợt 2 nhưng sự khác biệt rõ ràng hơn.
0 50 100 150 200 250 0 0,03 0,3 3 30 Số lƣợng. 10 8 CFU/m l Escherichia coli Đợt 1 Đợt 2 Đợt 3 0 50 100 150 200 250 300 0 0,03 0,3 3 30 Số lƣợng .1 0 8 CF U/m l Pseudomonas sp. Đợt 1 Đợt 2 Đợt 3
Hình 3.7. Kết quả đếm CFU/ml của mẫu đối chứng và sau khi nuôi trong môi trường có kháng sinh của Escherichia coli
Hình 3.8. Kết quả đếm CFU/ml của mẫu đối chứng và sau khi nuôi trong môi trường có kháng sinh của Pseudomonas sp.
Kết quả ở hình 3.7 và 3.8 cho thấy, sau khi nuôi liên tục nhiều ngày trong môi trường có Ciprofloxacin thì không chỉ số lượng mà hình thái khuẩn lạc của Pseudomonas
sp. và Escherichia coli đều có sự thay đổi so với mẫu đối chứng. Cụ thể, theo quan sát thì sau khi tiếp xúc với thuốc, trên đĩa của Escherichia coli có sự xuất hiện của các khuẩn lạc màu hồng nhạt hơn so với màu ban đầu, kích thước khuẩn lạc nhỏ hơn. Còn đối với đĩa
Đối chứng Có KS
của Pseudomonas sp. cũng có sự thay đổi tương tự như ở E.Coli, kích thước khuẩn lạc nhỏ hơn nhiều so với mẫu đối chứng.
Từ các kết quả trên , Ciprofloxacin đã ảnh hưởng đến mức độ sống của các chủng vi khuẩndù chỉ với ở nồng độ thấp.
3.1.4. Kết quả đánh giá hoạt tính phân giải enzyme của các chủng vi khuẩn
3.1.4.1. Kết quả đánh giá khả năng phân giải hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn khi chƣa nuôi trong môi trƣờng kháng sinh khuẩn khi chƣa nuôi trong môi trƣờng kháng sinh
Tiến hành thử khả năng phân giải protease, cellulase và amylase của 2 chủng vi khuẩn Pseudomonas sp. và Escherichia coli đã phân lập và định danh, ta thu được kết quả trình bày ở bảng 3.5.
Bảng 3.5. Khảo sát hoạt tính enzyme của các chủng vi khuẩn