- Tạo enzym phân hủy hoạc biến đổi kháng sinh
- Các vi khuẩn có khả năng tạo ra các enzym phân hủy hoặc biến đổi do đó làm mất tác dụng của kháng sinh. Ví dụ: Các vi khuẩn Streptococcus tạo ra beta lactamase phá hủy vòng beta lactam nên kháng được kháng sinh beta lactam.
- Các vi khuẩn kháng thuốc có thể do thay đổi vị trí repeptor gắn với thuốc, ví dụ: một số vi khuẩn kháng beta lactam do thay đổi receptor PBP (Penicilin Binding Proterin), penicilin không gắn được vào receptor trên vi khuẩn nên không có tác dụng diệt khuẩn.
Đối với trường hợp tiếp xúc lâu dài với kháng sinh nồng độ thấp trong môi trường tự nhiên thì cơ chế kháng thuốc không rõ ràng nên việc nghiên cứu tìm hiểu điều này là cần thiết.
1.7. Đại cƣơng về Ciprofloxacin 1.7.1. Nguồn gốc,lịch sử ra đời
Ciprofloxacin là kháng sinh có nguồn gốc tổng hợp, thuộc nhóm Quinolon thế hệ II [4]. Acid Nalidixic là quinolone đầu tiên được phát hiện vào năm 1960, được phân lập như một tạp chất trong sản xuất quinine và chủ yếu được dùng điều trị nhiễm khuẩn tiết niệu. Sau đó, vào những năm 1980, Ciprofloxacin cùng với Ofloxacin đã xuất hiện trên thị trường, thuốc có tác dụng diệt khuẩn toàn thân với tác dụng nhanh và mạnh hơn do khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn cao hơn. Gần đây những quinolon mới được phát triển như levofloxacin, moxifloxacin, gemifloxacin. [32]
1.7.2. Công thức hóa học
Ciprofloxacin cũng như các quinolone khác được bắt nguồn từ quinine, được gắn với F ở vị trí 6, và gốc piperazinyl-1 ở vị trí thứ 7. Dạng dùng là muối hydroclorid khan hay gậm nước hoặc muối lactat dễ tan hơn, thường dùng pha tiêm.
- Công thức hóa học: C17H18FN3O3
- Tên hóa học : 1-cyclopropyl-6-fluoro-4-oxo-7-piperazin-1-yl-quinoline-3- carboxylic acid
[4]
Hình 1.1. Công thức hóa học của Ciprofloxacin
1.7.3. Cơ chế tác dụng của thuốc
Ciprofloxacin gắn với ADN-gyrase và Topoisomerase IV của vi khuẩn làm mất hoạt tính enzyme. Do không có khả năng mở vòng xoắn để thực hiện việc sao chép mã di truyền nên vi khuẩn bị tiêu diệt [32].
1.7.4. Chỉ định
Ciprofloxacin được chỉ định trong điều trị các nhiễm trùng do vi khuẩn nhạy cảm, bao gồm: viêm đường tiết niệu trên và dưới, viêm tuyến tiền liệt, viêm xương tủy, viêm ruột vi khuẩn nặng, nhiễm khuẩn nặng mắc trong bệnh viện [32], Bệnh than, viêm dạ dày ruột, bệnh lậu, viêm vùng chậu, nhiễm trùng hô hấp đưới, sốt thương hàn và phó thương hàn, nhiễm trùng da và cấu trúc da, nhiễm trùng ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch [23], [49], Đợt cấp của sơ nang, nhiễm trùng tai mũi họng, nhiễm trùng do chấy rận. Thuốc cũng dùng để dự phòng não mô cầu và nhiễm trùng phẫu thuật [32].
1.8. Tổng quan tình hình nghiên cứu về tác động sinh thái lên vi khuẩn nƣớc mặt cũng nhƣ kháng kháng sinh ở vi khuẩn nƣớc mặt.
1.8.1. Trên Thế giới
Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu cho thấy thuốc kháng sinh được tìm thấy trong nước bao gồm: Mỹ, châu Âu [16][34], thậm chí tại Hàn Quốc. Tuy nhiên, dữ liệu từ các nước châu Á, bao gồm cả Hồng Kông và Trung Quốc đặc biệt khan hiếm. Trước năm 2005, chỉ có một báo cáo cho thấy phát hiện ofloxacin, nonfloxacin, Roxithromycin và erythromycin trong nước ở nồng độ rất thấp ở Hồng Kông ; sulfadiazine, sulfadimidine, sulfamethoxazole và chloramphenicol cũng được phát hiện ở sông Pearl, phía nam Trung Quốc, ở nồng độ tương đối cao [34]. Nghiên cứu về tác động của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn trong nước như nghiên cứu về độc tính của kháng sinh lên sinh vật thủy sinh của Chi, Siu-chung ở Hồng Kông [19]. Trong nghiên cứu này, 5 loại kháng sinh bao gồm ampicillin, tetracycline, trimethoprim, ciprofloxacin và cefalexin đã được kiểm tra độc tính cấp tính đến một loại vi khuẩn biển (Vibrio fischeri) và động vật không xương sống nước ngọt (Daphnia magna) được sử dụng như là vật chỉ thị để thử nghiệm độc tính của thuốc kháng sinh. Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc kháng sinh trên vi khuẩn nước của Iain Andrew Davies 2010, cho thấy tetracyclines và sulfonamid có thể có tác động đáng kể đến chức năng của vi sinh vật trong môi trường tự nhiên, dẫn đến thay đổi trong cấu trúc cộng đồng của các nhóm vi khuẩn có liên quan đến sinh thái (như vi khuẩn tham gia vào vi khuẩn nitơ và chu trình cacbon) [20]. Nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc kháng sinh fluoroquinolon lên sinh vật thủy sinh năm 2005 của April A. Robinson, Jason B. Belden, Michael J. Lydy [35]. Thử nghiệm độc tính đã được thực hiện với bảy loại thuốc kháng sinh fluoroquinolon, ciprofloxacin, Lomefloxacin, ofloxacin, levofloxacin, clinafloxacin, enrofloxacin, và flumequine, trên năm sinh vật dưới nước. Giá trị độc tính tổng thể dao động từ 7,9 đến 23.000 mg/L, trong đó vi khuẩn cyanobacteria Microcystis aeruginosa là sinh vật nhạy cảm nhất [34].
Bên cạnh đó, trong quá trình điều trị cũng như các công trình nghiên cứu về kháng sinh nói chung đã chỉ ra tình trạng kháng ciprofloxacin ngày càng phổ biến. Trong thử nghiệm in vitro, các chủng kháng ciprofloxacin bao gồm: Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, và Enterococcus faecalis [8]. Nhiều nghiên cứu công bố tỷ lệ Ps. Aeruginosa kháng ciprofloxacin ngày càng tăng và có những báo cáo công bố tỷ lệ kháng đến 90% [36]. Tình trạng A. baumannii kháng ciprofloxacin
cũng được báo cáo với tỷ lệ trên 80% [36]. S. aureus (bao gồm cả chủng kháng oxacilin) kháng với ciprofloxacin và các fluoroquinolones khác đã được báo cáo với tần số ngày càng tăng và tốc độ tương đối nhanh, nhiều nghiên cứu công bố tỷ lệ kháng ciprofloxacin tại bệnh viện đến 90% [7]. Salmonella kháng fluoroquinolones phổ biến ở Ấn Độ và Đông Nam Á [8]. K. pneumoniae kháng thuốc cũng đã được báo cáo và tỷ lệ E.coli kháng thuốc cũng ngày càng gia tăng [7]. Tuy nhiên, các nghiên cứu chủ yếu trên đối tượng vi khuẩn gây bệnh phân lập từ người và ở nồng độ cao của kháng sinh. Việc nghiên cứu về kháng kháng sinh cũng như ngưỡng gây kháng kháng sinh dưới nồng độ MIC đối với vi khuẩn phân lập từ tự nhiên được khẳng định là quan trọng và cần thiết trên cả 3 phạm vi in vivo,in vitro và in situ [52].
Ngoài ra, nghiên cứu về các gen kháng thuốc kháng sinh trong môi trường và tương quan với sự lây nhiễm do con người bằng kháng sinh của Björn Berglund, 2015 [37]. Nghiên cứu này chỉ ra rằng, các môi trường phi lâm sàng đã được nhấn mạnh như một yếu tố quan trọng trong việc phổ biến các gen kháng thuốc kháng sinh (ARGs), các hiện tượng chuyển gen ngang (HGT) thường xảy ra trong môi trường thuỷ sinh. Các nghiên cứu in vitro đã chỉ ra rằng các thuốc kháng sinh ở nồng độ thấp có thể gây ra các đột biến kháng thuốc và cũng có thể tạo điều kiện cho HGT. Nói chung, càng ngày càng rõ ràng rằng môi trường đóng một vai trò quan trọng trong việc phổ biến kháng kháng sinh. Cần phải nghiên cứu sâu hơn nữa để làm sáng tỏ các khía cạnh chính của quá trình này. Điều quan trọng là phải xác định được mức độ ô nhiễm kháng sinh trong môi trường nước, từ đó có thể xác định về khả năng lựa chọn các vi khuẩn đề kháng và HGT.
1.8.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam đã có các nghiên cứu về ảnh hưởng của ciprofloxacin lên vi khuẩn như theo Phạm Thu Lan và cộng sự tại viện Mắt TW mức độ kháng Ciprofloxacin của 5 vi khuẩn thường gặp của năm 2006 như sau: Staphylococus aureus kháng 41,7%;
Staphylococi cloagualase kháng 50%; Acinetobacter spp kháng 29,5%; P. aeruginosa
kháng 15,1%; Enterobacteriaceae kháng 25,7% [8]. Tại các khoa lâm sàng bệnh viện Chợ Rẫy từ tháng 02/2006-06/2006 theo Lê Thị Anh Thư và cộng sự tình trạng kháng Ciprofloxacin của một số chủng vi khuẩn như sau: A. baumanii kháng 72,2%; P. aeruginosa kháng 39,1%; K. pneumonia kháng 57,1% và E. coli kháng 66,7% [9]. Tại khoa điều trị tích cực bệnh viện Bạch Mai theo thống kê của Hồ Thị Hạnh từ tháng 06/2006-12/2007 tình hình kháng Ciprofloxacin của một số chủng vi khuẩn như sau: A. baumanii kháng 80%; P. aeruginosa kháng 66,67%; K. pneumonia kháng 72,73%. [11]
Tuy nhiên, nghiên cứu sự kháng kháng sinh của vi khuẩn trong nước mặt vẫn còn hạn chế cũng như chưa có nghiên cứu riêng về ảnh hưởng của ciprofloxacin lên vi khuẩn phân lập từ nước mặt. Việc mở ra hướng nghiên cứu về ảnh hưởng của ciprofloxacin lên vi khuẩn phân lập từ nước mặt ở Việt Nam có ý nghĩa quan trọng. Ðồng thời dựa vào hướng nghiên cứu này để mở rộng trên một số loại thuốc kháng sinh cũng như một số vi khuẩn khác, góp phần vào chiến lược định hướng sử dụng kháng sinh có hiệu quả và đảm bảo an toàn sức khỏe của con người.
Chƣơng 2
ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu
- Vi khuẩn được phân lập từ hồ công viên 29/3 Đà Nẵng
- Thuốc kháng sinh nghiên cứu là Ciprofloxacin, kháng sinh có nguồn gốc tổng hợp, thuộc nhóm Quinolon thế hệ II.
Hình 2.1. Thuốc Ciprofloxacin nghiên cứu
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và định danh một số loài vi khuẩn nước hồ công viên 29/3.
- Xác định một số enzyme chính của vi khuẩn.
- Nghiên cứu tác động Ciprofloxacin ở các nồng độ khác nhau lên mức độ sống của các loài vi khuẩn này.
- Nghiên cứu sự thay đổi về hoạt tính enzyme của các loài vi khuẩn sau khi tiếp xúc lâu dài với các loại kháng sinh ở các nồng độ khác nhau.
- Nghiên cứu thay đổi về mức độ nhạy cảm kháng sinh hoặc sự xuất hiện kháng kháng sinh của các loài vi khuẩn phân lập được đối với loại kháng sinh này tại các nồng độ tiếp xúc khác nhau.
- Đánh giá mối quan hệ tiềm tàng giữa hiện tượng kháng kháng sinh với sự thay đổi hoạt tính enzyme của các loài vi khuẩn này.
2.3. Địa điểm nghiên cứu
- Ngoài thực địa
Thu thập mẫu nước tại hồ công viên 29/3, Thành Phố Đà Nẵng để phân lập các chủng vi khuẩn cần nghiên cứu.
- Trong phòng thí nghiệm
Đề tài được tiến hành ở các phòng thí nghiệm khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư phạm Đà Nẵng: phòng thí nghiệm Sinh lý – Hóa sinh – Vi sinh; phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh học; phòng thí nghiệm Phân tích Môi trường. Phòng thí nghiệm tại Khoa Vi sinh của bệnh viện Đa khoa, Đà Nẵng.
2.4. Thiết kế thí nghiệm và phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Thiết kế thí nghiệm
Mục đích chủ yếu của thí nghiệm là xác định ảnh hưởng của thuốc Ciprofloxacin (nhóm fluoroquinolone) đến vi khuẩn nước trong nghiên cứu thí nghiệm.
Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của Ciprofloxacin với nồng độ khác nhau lên mức độ sống, hoạt tính enzyme của vi khuẩn và mức độ nhạy cảm với kháng sinh.
Thí nghiệm 1 : Vi khuẩn được nuôi trong các lọ chứa môi trường NB lỏng có
nồng độ thuốc ở các nồng độ thử nghiệm cuối cùng là tương đương với nồng độ loại kháng sinh đó được tìm thấy trong môi trường nước mặt, và cao hơn nồng độ đó từ 10 – 100 lần để mô phỏng nồng độ trong nước thải hoặc trong hoàn cảnh sử dụng kháng sinh với số lượng lớn hơn nhiều và không được kiểm soát chặt chẽ như các nước phát triển.(đối với mẫu đối chứng thay dung dịch thuốc bằng nước cất), lắc đều trên máy lắc (200 vòng/phút) cứ sau 24h mẫu vi khuẩn ở mỗi lọ được lấy ra để xác định mức độ sống, hoạt độ enzyme và cứ sau 48h vi khuẩn được cấy chuyền qua 2 đợt nữa trong môi trường giống môi trường ban đầu để tiến hành xác định mức độ sống, hoạt độ enzyme theo thời gian.
Bảng 2.1. Nồng độ thuốc thử nghiệm
STT Loại thuốc Các nồng độ thử nghiệm cuối cùng
Thí nghiệm 2: Xác định mức độ sống của vi khuẩn khi nuôi trong môi trường có
kháng sinh.
Pha loãng dung dịch vi khuẩn sau khi nuôi lắc theo phương pháp pha loãng 10 lần [1] để được mật độ phù hợp. Sau đó trải đều dung dịch vi khuẩn khuẩn có thuốc kháng sinh nuôi cấy trên đĩa petri và lật đĩa lại, ủ ở 28-30 độ C trong 24 giờ.Kết quả được tính là số khuẩn lạc phát triển của vi khuẩn sống sót. So sánh với mẫu đối chứng.
Thí nghiệm 3: Xác định sự thay đổi hoạt độ enzyme của vi khuẩn khi nuôi trong
môi trường có kháng sinh.
Sử dụng phương pháp đục lỗ trên đĩa thạch [1]. Thạch sau khi được đục lỗ sẽ lần lượt nhỏ 0,1ml dung dịch vi khuẩn nuôi trong kháng sinh sau 24h vào. Sau đó, để vào tủ ấm ở 28 – 30 độ C trong 48h. Đọc kết quả và so sánh đường kính phân giải so với lúc chưa thử thuốc.
2.4.2. Phƣơng pháp nghiên cứu và phân tích 2.4.2.1. Phƣơng pháp thu thập tài liệu
Tài liệu có liên quan đến nội dung nghiên cứu được thu thập từ các nguồn như sách, tạp chí, báo khoa học và trên mạng internet.
2.4.2.2. Phƣơng pháp thu mẫu
Các mẫu nước được lấy theo TCVN 5994 -1995 (ISO 5667/4: 1987) [5]
Chọn 05 vị trí thu mẫu khác nhau tại hồ sau đó trộn 5 mẫu lại để được 1 mẫu đặc trưng. Mẫu được bảo quản lạnh, không được để ánh sáng tiếp xúc trực tiếp với mẫu và vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm để phân tích.
2.4.2.3. Phƣơng pháp phân lập
Phân lập các mẫu dựa trên phương pháp phân lập của Egorow [1], [3].
Lấy 1ml dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm có chứa 9ml nước cất, lắc đều, ta có độ pha loãng 10-1. Hút ra 1ml cho vào ống nghiệm có chứa chứa sẵn 9ml nước cất, lắc đều, ta có độ pha loãng 10-2
. Tiếp tục pha loãng cho đến nồng độ cần thiết.
Dùng pipet tiệt trùng hút dịch pha loãng ở nồng độ từ 10-2 đến 10-6 khoảng 0,1ml nhỏ vào đĩa petri chứa môi trường phân lập đã vô trùng, dùng que gạt trang đều trên mặt thạch. Sau đó, bao gói cẩn thận và nuôi cấy trong tủ ấm ở nhiệt độ 30 – 350C. Sau 3 ngày nuôi cấy, chọn những chủng khuẩn lạc riêng lẽ, mọc mạnh, cấy sang ống thạch nghiêng chứa cùng môi trường phân lập cho đến khi thuần chủng.
2.4.2.4. Phƣơng pháp định danh vi sinh vật
Xác định các đặc điểm về hình thái, phản ứng sinh hóa, kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản: nhuộm Gram, tính di động, catalase, oxidase, khả năng sử dụng đường trong điều kiện hiếu khí và yếm khí (O/F), dựa theo phương pháp của Frerichs và Millar (1993), và Buller (2004). Đồng thời, sử dụng bộ kít API 20E (BioMerieux) để định danh đến loài vi khuẩn [12].
2.4.2.5. Phƣơng pháp giữ giống vi sinh vật
Theo phương pháp Egorow, để bảo quản chủng giống vi sinh vật cho những nghiên cứu tiếp theo chúng tôi tiến hành cấy lại định kì trên môi trường thạch nghiêng có cùng môi trường để ở tủ ấm ở 350C – 390C trong 2 -3 ngày. Sau đó bảo quản trong tủ lạnh ở 40
C, cấy chuyền định kì để giữ giống.
2.4.2.6. Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật
Vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa thích hợp đối với mỗi loại vi khuẩn.
( )
( )
2.4.2.7. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh hoạt tính enzim proteaza, xenlulaza và amylaza của vi sinh vật
Để xác định khả năng sinh hoạt tính enzym proteaza, xenlulaza và amylaza của vi sinh vật, chúng tôi dùng phương pháp đục lỗ thạch [1]. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc: khi enzym proteaza, xenlulaza và amylaza thủy phân casein, CMC và tinh bột có trong môi trường thạch sẽ tạo vòng phân giải màu trong suốt quanh lỗ thạch. Dựa vào số hiệu đường kính vào phân hủy và đường kính lỗ thạch mà ta xác định khả năng sinh hoạt tính enzym proteaza, xenlulaza và amylaza của vi sinh vật.
2.4.2.8. Phƣơng pháp xác định thời gian sinh trƣởng của vi khuẩn
Để xác định thời gian sinh trưởng của vi sinh vật tuyển chọn, chúng tôi tiến hành xây dựng đường cong sinh trưởng theo phương pháp nuôi cấy tĩnh [2].
2.4.2.9. Phƣơng pháp kháng sinh đồ
Phương pháp lập kháng sinh đồ được thực hiện theo tiêu chuẩn: The Clinical và Laboratory Standards Institute (CLSI) của Anonymous (2006), sử dụng môitrường
Mueller-Hinton Agar (MHA, Merck, Darmstadt, Germany) với khoanh giấy kháng sinh
Ciprofloxacin (5µg) (Bio-rad, Marnes-la-Coquettle, France) [13]
Chuẩn bị mẫu vi khuẩn cần đặt kháng sinh đồ. Nhặt 3-5 khuẩn lạc thuần trên đĩa sau đó hoà đều trong 3 - 5 ml nước muối sinh lý. Lắc đều bằng tay và so sánh tương đương với độ đục chuẩn Mc Farland 0,5, điều chỉnh độ đục bằng cách thêm nước muối