3.1. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HOÁ CỦA CÁC CAO CHIẾT CỦ RỄ CÂY SÂM ĐÁ
Phương pháp nhặt gốc tự do DPPH được sử dụng rộng rãi trong mơ hình nhằm khảo sát hoạt động nhặt gốc tự do của một số hợp chất tự nhiên, chẳng hạn như nhóm phenolic hay anthocyanin, hoặc hỗn hợp cao chiết thơ, như cao chiết methanol, cao chiết ethanol, cao chiết nước từ thực vật. Các DPPH được bắt bởi các chất kháng oxy hóa thơng qua sự chuyển electron tạo thành dạng DPPH khử. Sự thay đổi màu sắc từ màu tím sang màu vàng sau quá trình khử, thể hiện thơng qua sự giảm hấp thụ ở bước sóng 517 nm [44]. Trong đó, giá trị IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát. IC50 được định nghĩa là nồng độ của mẫu mà tại đó có thể ức chế 50% gốc tự do, hoặc tế bào, hoặc enzyme, mẫu có hoạt tính kháng oxy hố càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp.
Tác dụng kháng oxy hóa in vitro theo phương pháp DPPH của cao toàn phần (cao cồn và cao nước) và các cao phân đoạn từ thân rẽ cây Sâm Đá được thí nghiệm tại các nồng độ 15,64; 31,25; 62,5; 125; 250; 500 và 1000 μg/mL. Acid ascorbic là chất chứng dương được sử dụng trong thí nghiệm. Giá trị giá trị IC50 của cao chiết toàn phần và các cao phân đoạn cao chiết ở nồng độ khác nhau và acid ascorbic được trình bày ở bảng 3.1 và bảng 3.2
Bảng 3.1. Khả năng kháng oxy hóa in vitro của chất đối chứng acid ascorbic
ở các nồng độ khác nhau
Chất đối chứng
Nồng độ cao chiết (µg/ml) IC50 (µg/ml) 50 25 12,5 6,25 3,125 Phần trăm kháng DPPH (%) Axit ascorbic 90,68 ± 2,41 55,27 ±1,48 33.42 ± 0,91 23,17 ± 0,63 6,02 ± 0.27 18,19 ± 1,58
36
Bảng 3.2. Khả năng kháng oxy hóa in vitro của các mẫu cao chiết tổng từ củ
rễ cây Sâm Đá ở các nồng độ khác nhau
Cao chiết củ rễ cây Sâm Đá
Nồng độ cao chiết (µg/ml) IC50 (µg/ml) 1000 500 250 125 62,5 31,25 15,64 Phần trăm kháng DPPH (%) Cao chiết cồn 96 92,78 ± 3,20 75,36 ± 1,90 59,63 ± 2,3 45,25 ± 1,60 26,07 ± 0,90 13,56 ± 0,51 x 206,50 ± 7,44 Cao chiết cồn 80 79,48 ± 2,10 57,36 ± 1,87 48,25 ± 1,76 33,62 ±1,42 18,60 ± 0,64 10,47 ± 0,30 x 324,62 ± 10,85 Cao chiết cồn 70 89,36 ± 2,85 60,27 ± 1,25 52,21 ± 0,41 32,26 ± 0,20 19,20 ± 0,34 9,88 ± 0,20 x 368,85 ± 13,62
Kết quả minh hoạ ở bảng 3.1 và bảng 3.2 cho thấy tác dụng kháng oxy
hóa in vitro của các mẫu cao chiết tổng tăng dần theo nồng độ. Hơn nữa, tác
dụng kháng oxy hóa có sự khác biệt giữa nhóm cao chiết với các nồng độ chiết ethanol khác nhau. Giá trị IC50 của cao chiết ethanol 96, cao chiết ethanol 80 và cao chiết ethanol 70 củ rễ cây Sâm Đá lần lượt là 206,50 ± 7,44 µg/ml, 324,62 ± 10,85 µg/ml và 368,85 ± 13,62 µg/ml (Bảng 3.2). Song song với các mẫu thử, tiến hành tương tự với mẫu chứng dương acid ascorbic cho thấy tác
dụng kháng oxy hóa in vitro của acid ascorbic có giá trị IC50 là 18,19 ± 1,58
µg/mL (Bảng 3.1). Kết quả nghiên cứu của một số nhóm dược liệu thuộc họ gừng (gần với Sâm Đá) như cây Ngãi Trắng, cây Ngãi Tía, … cho thấy tác dụng kháng oxy hố có sự khác biệt giữa các nhóm này. Nhóm nghiên cứu của Nguyễn Trọng Tuân, 2019 khi tiến hành thu nhận cao chiết của củ rễ Ngải trắng, củ rễ Ngải tím và củ rễ Gừng gió bằng dung mơi ethanol và tiến hành đánh giá hoạt tính kháng oxy hố của 3 loại cao này bằng phương pháp DPPH.
37
Kết quả nghiên cứu cho thấy, cả 3 loại cao đều có hoạt tính kháng oxy hoá khá tốt, tuy nhiên tác dụng kháng oxy hố có sự khác biệt rõ rệt. Giá trị IC50 ở cao Ngải tím, cao Ngải trắng và cao Gừng gió lần lượt là 503,722 μg/ml, 108,984 μg/ml và 78,729 μg/ml. Trong đó, cao chiết Gừng gió cho hiệu quả tốt nhất (IC50 <100 μg/ml). Nhìn chung, trong 3 lồi thực vật trên thì Gừng gió và Ngải trắng có hoạt động loại bỏ gốc tự do DPPH tốt vì giá trị IC50 thấp. Hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH của các cao chiết được xếp theo thứ tự là cao Gừng gió>cao Ngải trắng>cao Ngải tím [45]. Ngồi ra, một số nghiên cứu tiến hành so sánh hiệu quả kháng oxy hoá của các cao chiết tổng khi tiến hành tách chiết bằng các dung môi khác nhau trên một số loại dược liệu gần với Sâm Đá như củ rễ cây Ngải trắng hay Ngải tím. Nghiên cứu của Srvidya và cs tiến hành thu nhận cao chiết thơ từ nhóm cây cùng chi với Sâm Đá là Ngãi Trắng (Curcuma
aromatica) và Ngãi Tím (Curcuma zeodaria). Khi ly trích Ngải trắng bằng
dung môi ethanol, chỉ số IC50 là 37,45 ± 2,5 µg/ml, trong khi ly trích bằng nước thì IC50 rất cao, 712,7 ± 2,66 µg/ml. Tương tự với mẫu Ngải tím, cao chiết nước có IC50 là 757 ± 13,5 µg/ml, cao hơn nhiều khi so sánh với cao chiết ethanol IC50 là 227,8 ± 4,875 µg/ml [46]. Kết quả tương tự như trong nghiên cứu của Lee cho thấy hoạt tính kháng oxy hố của Ngải trắng khi tiến hành chiết bằng dung môi ethanol cao hơn so với khi tiến hành chiết bằng dung môi nước [47]. Tất cả sự khác nhau của nghiên cứu trên có thể là do sự khác biệt về vị trí địa lý, thổ nhưỡng và giống thực vật nghiên cứu. Ngồi ra, cịn có thể là do khác nhau về dung môi chiết xuất, methanol là dung mơi có thể chiết xuất nhiều thành phần có hoạt tính sinh học hơn dung môi ethanol, tuy nhiên methanol là dung mơi có tính độc hơn ethanol. Từ kết quả này cho thấy, ethanol là dung môi phù hợp để ly trích tốt các thành phần có hoạt tính kháng oxy hóa trong chi
Curcuma. Vì vậy, nghiên cứu cũng đề xuất tiền hành ly trích cao chiết củ rễ
cây Sâm Đá bằng dung mơi ethanol. Với điều kiện ly trích là dung mơi ethanol
96o, chúng tơi thu nhận được cao chiết củ rễ cây Sâm Đá có hoạt tính kháng
oxy hóa thơng qua đánh giá khả năng bắt gốc tự do DPPH khá cao, với giá trị IC50 cụ thể đạt 206,50 ± 7,44 µg/ml.
38
3.2. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CAO CHIẾT CỦ RỄ CÂY SÂM ĐÁ CHIẾT CỦ RỄ CÂY SÂM ĐÁ
3.2.1. Khả năng gây độc của cao chiết trên tế bào ung thư
Nghiên cứu xác định cao chiết tổng củ rễ cây Sâm Đá có thể ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư hay không. Các tế bào ung thư gan người HepG2, ung thư vú người MCF7, ung thư đại tràng người Caco2 và ung thư da người A375 được xử lý với cao tổng ở các nồng độ khác nhau (0-200 μg/m l) tại các thời điểm khác nhau (12, 24, 48 giờ). Khả năng sống của tế bào được xác định bằng phương pháp WST-1 theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nguyên tắc hoạt động của bộ kit dựa trên phản ứng phân cắt hợp chất WST-1 tetrazolium bởi enzyme dehydrogenases có trong ty thể tế bào. Dehydrogenases là một enzyme trong chuỗi hơ hấp tế bào, chuyển hóa WST-1 tetrazolium thành formazan có màu vàng và hấp thu bước sóng 450 nm. Tế bào càng phát triển nhanh thì q trình hơ hấp và chuyển hóa của tế bào xảy ra mạnh, dẫn đến sự chuyển hóa WST-1 tetrazolium thành formazan bởi enzyme dehydrogenases xảy ra càng mạnh. Mức độ tăng sinh của tế bào có thể định lượng thông qua độ hấp thu OD (bước sóng 450 nm).
Trước tiên nghiên cứu tiến hành trên dòng tế bào ung thư vú MCF7 với các nồng độ khác nhau của cao chiết tổng ở 3 thời điểm sau 12 giờ, sau 24 giờ và sau 48 giờ xử lý với cao chiết. Kết quả nghiên cứu cho thấy sau 12 giờ và 24 giờ xử lý với cao tổng ở các nồng độ khác nhau, tỉ lệ tế bào sống khơng có sự khác biệt giữa các nhóm tế bào được xử lý với cao chiết và nhóm tế bào đối chứng (P > 0,05; Hình 3.1). Tuy nhiên, sau 48 giờ, hiệu quả ức chế tăng sinh tế bào MCF7 bởi cao tổng chỉ được quan sát thấy rõ ở các nồng độ cao (100-200 μg/ml). Cụ thể, tỉ lệ tế bào sống ở các nhóm tế bào MCF7 được xử lý với các nồng độ cao tổng 50, 100 và 150 μg/ml lần lượt là 6,82 ± 1,94%, 31,84 ± 3,17% và 54,76 ± 4,23% khi so sánh với nhóm đối chứng (P < 0,05 và P < 0,01; Hình 3.1). Ở nồng độ cao nhất 200 μg/ml, tỉ lệ tế bào sống còn 31,23 ± 2,62%. Ngoài ra, nghiên cứu cũng xác định được chỉ số gây độc 50% quần thể tế bào của cao tổng (IC50) là 91,16 ± 2,25 μg/ml (100-150 μg/ml) (Bảng 3.9). Như vậy, kết quả cho thấy cao tổng có thể ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư MCF7 phụ
39
thuộc vào nồng độ xử lý, tuy nhiên tác động ức chế tăng sinh tế bào chỉ quan sát thấy rõ ở các nồng độ cao.
Hình 3.1. Ảnh hưởng của cao chiết tổng củ rẽ cây Sâm Đá lên sự tăng sinh của
tế bào ung thư vú. Sự tăng sinh tế bào MCF7 được xác định bằng WST-1 sau khi xử lý với cao chiết ở các nồng độ khác nhau ở các thời điểm. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm. **p < 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với đối chứng.
Tương tự như vậy, nghiên cứu tiếp tục xác định ảnh hưởng của cao chiết tổng củ rẽ cây Sâm Đá lên sự tăng sinh của một số dòng tế bào ung thư khác như ung thư gan HepG2, ung thư đại trực tràng Caco2 và ung thư da A375. Kết quả nghiên cứu tương tự được ghi nhận trên dòng tế bào ung thư gan HepG2, ung thư đại trực tràng Caco2 và ung thư da A375 khi các tế bào này cũng được xử lý với cao tổng ở các nồng độ khác nhau tại các thời điểm xác định. Sau 48 giờ xử lý, ở các nồng độ 100, 150 và 200 µg/ml của cao chiết, các dịng tế bào ung thư khác nhau đều cho thấy sự ức chế tăng sinh tăng dần, khi so sánh với đối chứng (P < 0,05 và P < 0,01). Nghiên cứu cũng xác định được chỉ số IC50 của cao tổng trên dòng tế bào HepG2, tế bào A375 và tế bào Caco2 lần lượt là 101.19 ± 3.02 μg/ml, 83.02 ± 3.17 μg/ml và 76.48 ± 2.84 μg/ml (Bảng 3.3).
40
Hình 3.2. Ảnh hưởng của cao chiết tổng củ rẽ cây Sâm Đá lên sự tăng sinh của
các dòng tế bào ung thư khác nhau. Sự tăng sinh tế bào MCF7, HepG2, Caco2 và A375 được xác định bằng WST-1 sau khi xử lý với cao chiết ở các nồng độ khác nhau sau 48 giờ. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm. **p < 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với đối chứng.
Dựa trên chỉ số IC50 cho thấy tác động gây độc của cao tổng củ rễ cây Sâm Đá trên các dòng tế bào ung thư khác nhau trong cùng một điều kiện thí nghiệm. Trong đó, cao chiết tổng củ rễ cây Sâm Đá có tác dụng ức chế mạnh nhất trên dòng tế bào đại trực tràng Caco2.
Bảng 3.3. Mức độ gây độc 50% quần thể tế bào (IC50) của cao tổng củ rễ cây
Sâm Đá trên các dòng tế bào khác nhau sau 48 giờ xử lý
Đơn vị tính: μg/ml
Cao chiết Tế bào MCF7 Tế bào HepG2 Tế bào Caco2 Tế bào A375
41
3.2.2. Khả năng gây độc của cao chiết trên tế bào thường
Tương tự, mức độ gây độc của cao chiết cũng được xác định trên cả 1 dòng nguyên bào sợi WS1 và 1 dịng tế bào nội mơ HUVEC. Các tế bào WS1 và HUVEC lần lượt được xử lý với cao chiết ở các nồng độ khác nhau. Khả năng sống của tế bào cũng được xác định bằng phương pháp thử WST-1. Kết quả cho thấy, ở các nồng độ và thời điểm xử lý khác nhau, mức độ gây độc 50% quần thể tế bào (IC50) của cao chiết đều cao hơn 200 μg/ml trên cả hai dòng nguyên bào sợi WS1 và HUVEC (Hình 3.3)
Hình 3.3. Ảnh hưởng của cao chiết lên sự tăng sinh của nguyên bào sợi WS1
và tế bào nội mô HUVEC. Sự tăng sinh tế bào được xác định bằng WST-1 sau khi xử lý với cao chiết ở các nồng độ khác nhau. Kết quả biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của ba lần lặp lại thí nghiệm. **p < 0,01 và *p < 0,05 khi so sánh với đối chứng.
Trong nghiên cứu của chúng tôi, cao chiết ethanol từ củ rễ cây Sâm Đá cho thấy các tác dụng ức chế tăng sinh trên các dòng tế bào ung thư khác nhau, chẳng hạn như tế bào MCF7, tế bào A375, tế bào Caco2 và tế bào HepG2. Trong số đó, cao chiết ethanol từ củ rẽ cây Sâm Đá thể hiện tác dụng chống tăng sinh mạnh nhất đối với tế bào Caco2 với IC50 là 76,48 ± 2,84 μg/ml. Theo nghiên cứu của Geran và cộng sự, cao chiết tổng củ rễ cây Sâm Đá của chúng tôi thể hiện hoạt động chống ung thư ở mức trung bình [48]. Cao chiết ức chế
42
sự tăng sinh của tế bào Caco2 phù thuộc vào nồng độ sử dụng. Những kết quả này cũng được ghi nhận bởi sự thay đổi hình thái tế bào và hình thái nhân như sự co rút tế bào chất và không bào quan sát được trong các tế bào được xử lý cao chiết. Một nghiên cứu trước đây đã báo cáo rằng chiết xuất ethanol của cây
Curcuma phaeocaulis Valeton làm giảm đáng kể sự gia tăng của các tế bào ung
thư vú MCF-7 và MDA-MB-231 [49]. Tương tự, cao chiết thô methanol của
thân rễ Curcuma zedoaria cho thấy tác dụng gây độc tế bào ung thư dạ dày
AGS [50]. Ngược lại, tác dụng gây độc tế bào không quan sát thấy ở ngun bào sợi và tế bào nội mơ bình ở nồng độ tương đương (IC50> 200μg/ml). Các kết quả này cho thấy rằng các dòng tế bào ung thư nhạy cảm với cao chiết tổng củ rễ cây Sâm Đá hơn các dịng tế bào bình thường. Một kết quả tương tự đã được báo cáo bởi nghiên cứu của Hadisaputri cho thấy cao chiết ethanol của
thân rễ Curcuma zedoaria gây độc tế bào đối với tế bào ung thư thực quản
người TE-8, nhưng ít gây độc đối với tế bào thực quản HET-1A [51]. Nghiên
cứu cho rằng một số hợp chất sinh học trong cao chiết ảnh hưởng đến khả năng tăng sinh của tế bào ung thư. Ngoài ra, tốc độ phát triển nhanh và sự di cư của tế bào ung thư có thể dẫn đến độ nhạy cao của tế bào ung thư với các hợp chất kháng ung thư có trong cao chiết
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA CAO CHIẾT LÊN SỰ TĂNG SINH CỦA TẾ BÀO UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
3.3.1. Ảnh hưởng của cao chiết lên khả năng sống của tế bào ung thư đại trực tràng
Trước tiên, nghiên cứu đánh giá hiệu quả gây độc của cao tổng lên tế bào ung thư đại trực tràng Caco2. Các tế bào Caco2 được xử lý với cao chiết ở các nồng độ khác nhau và ở các thời điểm xác định. Hiệu quả ức chế tăng sinh tế bào dược đánh giá bằng phương pháp WST-1 theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Nguyên tắc hoạt động của bộ kit dựa trên phản ứng phân cắt hợp chất WST-1 tetrazolium bởi enzyme dehydrogenases có trong ty thể tế bào. Dehydrogenases là một enzyme trong chuỗi hơ hấp tế bào, chuyển hóa WST-1 tetrazolium thành formazan có màu vàng và hấp thu bước sóng 450 nm. Tế bào càng phát triển nhanh thì q trình hơ hấp và chuyển hóa của tế bào xảy ra mạnh, dẫn đến sự
43
chuyển hóa WST-1 tetrazolium thành formazan bởi enzyme dehydrogenases xảy ra càng mạnh. Mức độ tăng sinh của tế bào có thể định lượng thơng qua độ