Chương 2 Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa in vitro
Nguyên tắc của phương pháp là sử dụng 1,1- diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Hoạt tính kháng oxy hóa của mẫu thử được đánh giá dựa trên khả năng loại bỏ gốc tự do thông qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng độ hấp thu quang của dung dịch sau phản ứng đo tại bước sóng 517 nm. DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để kiểm tra khả năng loại bỏ gốc tự do và các nhóm cho hydro, phương pháp này cũng được sử dụng để định lượng các chất oxy hóa trong hệ thống sinh học phức tạp ngày nay. Những electron lẻ có trong gốc tự do DPPH cho sự hấp thu mạnh nhất ở bước sóng 517 nm và
29
hợp chất này có màu tím. Khi các electron lẻ này kết hợp với hydro của chất kháng oxy hóa để hình thành dạng DPPH-H, hợp chất sẽ chuyển từ màu tím sang vàng tương ứng với lượng electron kết hợp với DPPH [43]. Vì vậy, khả năng làm sạch gốc tự do của một chất càng cao thì sự hấp thu quang phổ được đo ở bước sóng 517 nm của phản ứng DPPH có giá trị càng thấp và ngược lại. Các chất có khả năng kháng oxy hóa (A) sẽ trung hịa gốc 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazin (DPPH) tạo ra hydrogen (DPPH ̇ + Aà DPPH-H +A ̇ ), làm giảm cường độ màu hấp thu ánh sáng của các gốc tự do DPPH tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Phương pháp trung hòa gốc tự do DPPH theo cải biên của Nguyễn Thị Thu Hương và cộng sự (2006). Dung dịch DPPH được chuẩn bị ở nồng độ DPPH 0,6 mM. Các mẫu cao chiết được pha loãng thành dịch chiết bằng methanol hoặc ethanol ở nồng độ 1000 µg/mL và tiến hành pha loãng bậc 2 để đạt được các nồng độ (31,25 µg/mL; 62,5 µg/mL; 125 µg/mL; 250 µg/mL; 500 µg/mL; 1000 µg/mL). Mẫu đối chứng dương được sử dụng là acid ascorbic pha loãng bằng methanol hoặc ethanol với nồng độ 10 µg/mL; 20 µg/mL; 30 µg/mL; 40 µg/mL; 50 µg/mL. Mẫu được chuẩn bị trên đĩa 96 giếng, gồm cả Đối chứng âm (100 µl dịch chiết được thay thế bằng 100 µl dung dịch methanol hoặc ethanol) và Đối chứng dương (100 µl dịch chiết được thay thế bằng 100 µl methanol hoặc ethanol chứa acid ascorbic). Một hỗn hợp phản ứng gồm 100 µl mẫu dịch chiết và 100 µl dung dịch DPPH 0,1 mM (hòa tan trong methanol hoặc ethanol).
Trộn đều hỗn hợp và đem ủ tối trong 30 phút ở nhiệt độ 37oC. Sau đó mẫu được
đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm, mỗi mẫu được lặp lại 3 lần. Hoạt tính kháng oxy hóa (HTCO) (%) được tính theo cơng thức
Khả năng kháng oxy hóa (%) = OD"−OD#
OD" × 100
Trong đó, ODa: mật độ quang của mẫu cao chiết, ODb: mật độ quang của mẫu đối chứng.
Phân tích số liệu trên phần mềm Excel được phương trình logarit giữa nồng độ mẫu thử và HTCO (%) có dạng y = aln(x) + b, thế y = 50 để suy ra IC50 (khả năng trung hòa 50% DPPH của mẫu). Giá trị IC50 càng thấp tương
30
ứng với HTCO càng cao và ngược lại. Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị trung bình của 3 lần đo khác nhau.