Chương 2 Vật liệu và Phương pháp nghiên cứu
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.5. Phương pháp đánh giá mức độ gây độc hay ức chế tăng sinh tế bào
Các dòng tế bào ung thư HepG2, ung thư da A375, ung thư vú BT474, ung thư đại trực tràng Caco2 và nguyên bào sợi trong các ống đông lạnh
(cryovial) được giải đông nhanh ở 37oC trong bể ổn nhiệt từ 2-3 phút dựa trên
phương pháp “đông lạnh chậm, giải đông nhanh”. Huyền phù tế bào được chuyển vào ống ly tâm (15 ml) có bổ sung mơi trường ni cấy DMEMF12 với 10% FBS và 0,5% kháng sinh Pen/Strep, sau đó ly tâm 1500 v/p, loại bỏ dịch nổi và thu lại cặn tế bào ở đáy ống ly tâm. Toàn bộ dung dịch tế bào huyền phù
được chuyển vào đĩa nuôi cấy tế bào 100 mm và nuôi cấy ở 37oC và 5% CO2.
Sau 12-24 giờ, môi trường cũ được loại bỏ và môi trường nuôi cấy phục hồi mới với 20% FBS được thay thế. Tế bào tiếp tục được nuôi cấy phục hồi từ 4- 7 ngày trước khi chuyển sang giai đoạn tăng sinh. Tế bào được nuôi cấy tăng sinh với môi trường tăng sinh phù hợp, bổ sung 10% FBS và 0,5% kháng sinh Pen/Strep. Môi trường nuôi cấy tế bào được thay từ 2-3 lần/tuần. Khi tế bào đạt 80% diện tích bề mặt ni cấy, tế bào được cấy chuyển bằng Trypsin/EDTA 0,25% theo tỉ lệ 1: 3. Sau đó, tế bào được nuôi cấy tăng sinh và thu nhận khi đạt được lượng tế bào cần thiết. Các dòng tế bào được kiểm tra các thông số như tỉ lệ sống chết, khả năng tăng sinh, sự nhiễm khuẩn, nhiễm mycoplasma trước khi tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.5. Phương pháp đánh giá mức độ gây độc hay ức chế tăng sinh tế bào bào
Khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào ung thư của cao chiết được thực hiện bằng phương pháp WST-1 (Roche, Thụy Sĩ). Ngoài ra, ảnh hưởng của dịch chiết lên hình thái tế bào được kiểm tra khi quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi (Olympus, Nhật). Tế bào được nuôi trên đĩa 96 giếng ở mật độ tế
bào 5 x 103 tế bào/giếng hoặc 1 x 104 tế bào/giếng (tùy thuộc mỗi dòng tế bào).
Sau 8-12 giờ, tế bào bám dính được xử lý với cao tổng hay cao phân đoạn ở các nồng độ khác nhau và được nuôi cấy tiếp trong 24-48 giờ. Nguyên bào sợi được xử lý tương tự và được sử dụng làm đối chứng. Sau mỗi thời điểm xác
31
định, dung dịch WST-1 (10 µl) được thêm vào mỗi giếng trong điều kiện vô trùng, tránh ánh sáng. Mẫu tế bào được trộn đều bằng máy lắc với tốc độ 300- 500 v/p trong 30 giây và ủ ở 37°C và 5% CO2. Sau 4 giờ, mẫu được lắc đều trong 20 giây và xác định giá trị hấp thu (OD) bằng máy đọc đa chức năng Multimode Plate Readers (Promega, Hoa Kỳ) tại bước sóng 450 nm. Kết quả được xác định thông qua giá trị OD của mỗi mẫu. Giá trị OD được sử dụng để phân tích tỉ lệ tế bào sống hay tỉ lệ ức chế tế bào tăng sinh theo các công thức sau:
Tỉ lệ tế bào sống (%) = E OD mẫu
OD đối chứngF X 100%
Tỉ lệ ức chế (%) = E1 − OD mẫu
OD đối chứngF X 100%